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文档简介
1、 山东大学实验报告 2011年3月27日姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 200900140177 同组者 于潜科目 生物化学实验 题目 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 仪器编号 105一、 实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。二、 实验原理蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH值大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH的溶液中,所带净电荷不同,故可利用电泳法将它们分离。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等,各种蛋
2、白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。由表可知,血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0,所以在pH8.6的缓冲液中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.88690001-球蛋白5.062000002-球蛋白5.06300000-球蛋白5.1290000150000-球蛋白6.857.50156000300000在一定范围内,蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下,分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相
3、对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时1、2、球蛋白升高,-球蛋白降低。肝硬化时2、-球蛋白降低,而1、-球蛋白升高。三、 实验器材1、醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120m)2、人血清;3、烧杯及培养皿 数只;4、点样器;5、竹镊子;6、玻璃棒;7、电吹风;8、试管 六只;9、恒温水浴锅;10、电泳槽;11、直流稳压电泳仪;12、剪刀四、 实验试剂1. 电极缓冲液2. 染色液(可重复使用,使用后回收)3. 漂洗液(100ml每组):95%乙醇45ml,冰醋酸5ml,水50ml。4. 透明液(20ml每组):无水乙醇:冰醋酸
4、=7:3。5. 健康人血清(新鲜,无溶血现象)。6. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液:取两个大烧杯,分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中;五、 实验步骤1 薄膜浸泡:提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上;2 电泳仪检查:水平检查,电源检查;3 电泳槽的准备:在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折,翻过来,用电极缓冲液完全浸湿,架在电泳槽的四个膜支架上,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,故称为滤纸桥。4 点样:取新鲜血清于载玻片上,将盖玻
5、片掰呈适宜大小,使一边小于薄膜宽度。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出,用滤纸吸去表面多余的液体,然后平铺在滤纸上,将盖玻片在血清中轻轻划一下,再在膜条一端1.52cm处轻轻地水平落下并迅速提起,即在膜条上点上了细条状的血清样品,呈淡黄色。5 电泳:用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路,调节电压到90V,预电泳10min,再调电压至110V,电泳时间50min1h。6 染色:将染液倒入大培养皿中,电泳完毕立即用镊子取出薄膜,直接浸入染色液中,染色9min,
6、然后取出。7 漂洗:配制好漂洗液,将染色完毕的薄膜自染液中取出,直接放入漂洗液中,连续更换几次漂洗液,直到薄膜背景几乎无色为止。8 透明:配制好透明液,用镊子将薄膜取出,贴在容器壁上(烧杯壁或培养皿上等),注意不可有气泡,用吹风机稍吹干薄膜,用胶头滴管淋洗薄膜,将每组20ml透明液淋洗玩即可,再用吹风机将薄膜彻底吹干,此时薄膜透明,小心将薄膜自容器壁上取下。六、注意事项1. 点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多,点样位置要合适。 2. 两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面,否则会因虹吸影响电泳效果。3. 醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大,以防止薄膜干燥
7、,电泳图谱出现条痕。 七、实验结果 染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起,依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白和球蛋白。下面是通过本次实验获得的一条电泳带:八、结果分析本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好,主要的问题有以下几个:1. 有些电泳带参差不齐;2. 个别电泳带的两条带之间界限不明显;分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点:1. 将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜;2. 用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中,薄膜可能受到了异物污染;3. 缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨;4. 电流强度控制的不好,因为电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增
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