生物医学在体成像技术作用

1、生物医学在体成像技术作用 本文作者：兰海云 汪爱勤 尹文 单位：第四军医大学基础医学部 第四军医大学基础医学部 第四军医大学中心实验室 在体成像技术的发展及成像策略的不断提高，能够在活的生物体内揭示细胞和分子水平的诸多细微变化，有助于在生物整体、真实的体内环境中高时间分辨率地研究生命过程。针对某一生物过程的带有光学标记的报告基因已被广泛应用于细胞生物学的研究，近年来正被更多地用于在活的动物模型中探究人体内生理机能和疾病的生物学过程。利用荧光蛋白、萤光素酶基因等生物材料标记细胞、病原体和基因，早已被证实是一种在体内设置检测器、体外直观检测的非常可行的策略1。 1在体生物发光成像技术的原理 通过生

2、物技术将构建的以萤光素酶基因作为标记基因的载体（重组原核表达质粒、重组真核表达质粒或重组病毒），经转化、转染或感染并筛选得到重组病原菌、细胞（如免疫细胞、肿瘤细胞、胚胎干细胞等）或重组病毒（如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等）用于转入小动物；或是将含萤光素酶及调控序列的载体线性化后经显微注射等技术稳定整合于小动物基因组制备转基因动物24。标记基因的表达可通过多种调控元件进行调控，如靶基因的启动子和增强子等；标记的方法因研究领域、研究目的和实验策略的不同而各异4，但最终都是在体内组织如血液、肝脏、脑、脾、肾等靶部位因特定生物过程的发生而伴随产生有酶活性的萤光素酶。在注入底物即萤光素的条件下，萤光素酶

3、催化底物反应产生特定波长的光信号，通过成像系统可以直观检测到光信号的产生及变化，实时反映体内发生的生物过程，如基因的调控表达、信号传导、蛋白质之间的相互作用、细胞增殖与分化等。因此，在体生物发光成像技术可广泛应用于分子生物学、细胞生物学、病毒学与免疫学、肿瘤学等研究领域58。 2在体生物发光成像技术的应用 21标记于肿瘤细胞、免疫细胞、胚胎干细胞等，转入体内后进行成像 萤光素酶基因作为一种报告基因，最初应用于体外培养细胞内目的基因的表达研究。在体生物发光成像技术的发展，使其能够应用于在体组织细胞的表达研究9。萤光素酶是一类生物发光酶，1种细胞可同时被2种具有不同底物的萤光素酶标记。例如其一可由

4、一组成性稳定表达的启动子驱动，作为内参，反应细胞数量的变化；另一萤光素酶由要研究的组织特异性启动子驱动，其发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反映特定的启动子在动物体内的表达活性1011。 211肿瘤及抗肿瘤研究在体生物发光成像技术可直接实时地监测各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。klerk等12研究证实了利用此技术测量肿瘤负荷具有很高的可靠性。minn等13应用该技术进行了乳腺癌肺转移相关基因的研究，他们构建能够表达荧光蛋白、萤光素酶的反转录病毒载体，并稳定转染已获得的不同亚群肿瘤细

5、胞，先通过荧光激活细胞分选术筛选同一亚群内具有相同转染效果（稳定表达外源蛋白即荧光蛋白和萤光素酶，且水平一致）的细胞，并尾静脉注射免疫缺陷小鼠，通过检测生物发光的部位和大小，评价不同亚群肿瘤细胞向肺部位的转移情况及其转移能力，再通过检测细胞内各基因的表达差异来分析肺转移相关基因。gupta等1516又用相似的方法来研究乳腺癌脑转移相关基因及乳腺癌肺转移过程中分化基因介导的肿瘤再起始，结果再次显示了生物发光成像技术应用于肿瘤及癌转移机理研究领域的优越性。 212抗肿瘤免疫及肿瘤细胞疫苗的研究用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞或基因修饰的肿瘤细胞疫苗，可以检测放射及化学药物治疗的效果，并可寻找在

6、肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。cayeux等17用萤光素酶基因标记基因修饰的肿瘤细胞疫苗来免疫小鼠，而用另一种底物不同于前者的5，6carboxysuccinimidylfluorescein标记该小鼠内一种与肿瘤相关的免疫细胞，通过2种不同的标记研究了基因修饰的肿瘤细胞疫苗免疫小鼠后抗原递呈、免疫细胞之间的相互作用及不同免疫细胞在体内免疫过程中的作用。 213药物促肿瘤细胞凋亡的研究当萤光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无萤光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase3在特异识别位点切去抑制多肽，萤光素酶活性得到恢复，由此

7、可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件。细胞凋亡时被激活的caspase37与devd氨基萤光素（aminoluciferin）特异结合而被酶解为氨基萤光素，它可被萤光素酶识别而产生生物发光信号。liu、hickson等1819利用这一现象设计的细胞凋亡检测方法均能够以极低的devd氨基萤光素量获得较强的发光强度，因而这一方法可用于评价tnfα（α肿瘤坏死因子）、fasl、trail（tnf相关促凋亡配体）等因素针对肿瘤的治疗效果。 214胚胎干细胞及再生医学的研究胚胎干细胞在再生医学领域极具应用前景，然而注入活机体的胚胎干细胞及其分化细胞尚存在显著的细胞死亡、畸胎瘤

8、的形成、宿主免疫排斥反应等障碍。应用在体生物发光成像技术，可对胚胎干细胞本身及其在注入机体后的存活、增殖、分化等生物事件的发生机理进行深入研究，从而使上述诸多问题得以解决20。 22标记病原微生物，用于研究感染致病机制、转移途径及宿主免疫反应等 在感染性疾病的研究中，在体生物发光成像技术的应用，不仅可以提供疾病进程中观测病原体在动物体内的寄居部位、数量变化及对外界因素的反应等实时变化信息，而且更有助于揭示感染体内病原体逃逸宿主防御的机制21。对病原体感染过程非侵入性的检测能够对疾病进程实时地提供新的信息，且有可能发现新的感染位点22。lucker等2326以萤光素酶基因标记hsv1（单纯疱疹病

9、毒）并分别侵染类干扰素受体缺失、类干扰素受体缺失、和类干扰素受体均缺失的小鼠，可观察到hsv1对不同干扰素受体缺失小鼠的肝脏、肺、脾、淋巴结的侵袭，及病毒从血液系统进入神经系统的过程，从而证实了不同干扰素在hsv1感染中所起的不同的作用。lucker等27针对痘苗病毒的类似研究也证实，不同干扰素在机体感染过程中各自和协同发挥的重要作用。#p#分页标题#e# 23标记于基因治疗载体用于探究基因治疗机制和评价治疗效果 将一个或多个目的基因安全有效地转入体内靶细胞可用于基因治疗，应用萤光素酶基因作为报告基因构建载体，观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和特异性表达。这种非侵入方式具有容易准备、

10、低毒性及轻微免疫反应的优点。萤光素酶基因也可以插入脂质体包裹的dna分子中，用来观察脂质体为载体的dna运输和基因治疗情况。smith等28已经运用该技术进行了hsv作为肝脏疾病基因治疗载体的可行性研究。chou等29将带有萤光素酶基因标记的稳定表达肝细胞癌抗原的质粒转入沙门菌减毒株，并作为疫苗口服免疫模型小鼠，在体成像显示了体内沙门菌成功表达抗原和沙门菌作为活菌疫苗在体内的清除过程。 24蛋白质间相互作用、信号转导等的研究 蛋白片段互补策略广泛用于研究细胞内蛋白质间的相互作用，这种策略在借助在体生物发光成像技术后就可以被运用到活体动物内，以非侵入、可量化、实时地显示蛋白质之间的相互作用31。

11、在动物体内直接观察细胞中或活体动物体内2种蛋白质的相互作用，可将firefly萤光素酶（fluc）的n端与c端分离开，分别与2个可能产生相互作用的目的蛋白相连，并使2组蛋白由不同的载体分别诱导表达。在体的细胞内若2个目的蛋白能靠近并结合形成完整的fluc，则会产生发光信号。andrea等32建立了一种转基因报告小鼠，由特异启动子（tgg4f（）及其转录反式作用因子多联体蛋白gal4进行调控。将融合了gal4bd的p53和融合了vp16的tag的病毒载体共转入该小鼠的肝脏细胞，在小鼠肝脏部位观察到了明显的发光信号，显示p53与tag的结合引发gal4bd与vp16结合，结合的多联蛋白顺利与启动子

12、tgg4f（）结合，进而引发fluc在肝脏组织的表达。 25体内干扰rna及dna疫苗的研究 目前rna干扰技术已经发展成为一种体外转录后沉默基因的方法，在体内rna干扰的转录后表达沉默可以引起各种广泛的生物学效应，因此生物发光在体成像技术有力地促进了体内rna干扰的研究和在体内利用rna干扰技术进行其他疾病机理及生物治疗的探索。mccaffrey33等通过将表达萤光素酶的真核表达载体与针对萤光素酶基因设计的双链小干扰rna（sirna）共注射成年小鼠，与对照组比较，前者的荧光强度明显减弱，表明针对性的双链sirna明显起到抑制基因表达的作用。他们还构建表达功能性小发夹rna（shrna）的真

13、核表达载体，与表达萤光素酶的载体共注射成体小鼠，与对照组相比，同样观察到长时程后荧光强度明显减弱。rna干扰技术成功用于临床治疗须保证双链sirna有效转入体内并维持有效的浓度，而借助在体生物发光成像技术则可便捷准确地评价双链sirna运送方法的效果。takeshita等3436已利用该技术分别对各自所设计的不同的双链sirna运送方法进行了全面的评价，并发现合理的运送方法，如双链sirna与某些小分子化合物的连接修饰与单独的注射双链sirna相比，前者能使双链sirna在体内较长时间内不被降解。rna干扰可作为传统dna疫苗的补充，被用以在体内消除免疫抑制因子表达。dna疫苗的效应常常因相关

14、的信号转导途径下调该获得性免疫反应而受到限制。因此，免疫抑制性的信号途径的沉默将是dna疫苗效能得到加强的一种极有潜力的策略。huang等37应用在体生物发光技术所做的研究结果显示，皮下注射编码shrna的dna，可以作为体内基因沉默和一种能够有效提高dna疫苗效果的手段。 26标记于转基因载体建立转基因动物模型 261基因表达动物模型为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达的，可将萤光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达及其他生物事件引起的相应基因表达或关闭。chen等37将

15、受胰岛素调控启动子调控表达萤光素酶的转基因小鼠制成糖尿病小鼠模型，采用在体生物发光成像技术证实了肝脏组织中含有可生成胰岛素的细胞。研究结果也证实了在转录调控序列和反式转录因子与目的基因相同的情况下，萤光素酶的表达水平及底物发光强度能够真实反映目的基因的表达状况。目前对于调控多药耐药性基因1（mdr1a）表达的关键因子和胞内微环境的机制尚不明了，使多药耐药性依然成为对癌症患者成功化疗的一大障碍。为深入研究mdr1a在体内组织中转录调控的机制，long等38通过胚胎干细胞同源重组、遗传杂交的手段构建了基因型为mdr1afluc的转基因小鼠（野生型基因型为mdr1a）。mdr1afluc中fluc已

16、完全置于mdr1a开放读码框中，其表达受内源性mdr1a启动子及相应各种反式作用因子的调控，western印迹等不同方法均验证了该模型mdr1a的表达量与firefly萤光素酶蛋白表达、发光强度成正比。该小鼠体内fluc的表达与mdr1a的表达在时间、所处的微环境均完全一致，可作为研究各种因素下mdr1a表达调控的理想的动物模型。类似的研究所建立的模型能弥补体外细胞培养不能提供的特定基因表达的真实微环境的缺点，也能弥补基因敲除小鼠存在的代偿效应等不足39。 262各种疾病模型研究者根据研究目的，将致病基因、病毒及细菌进行萤光素酶标记，转入动物体内形成所需的疾病模型，包括免疫系统疾病、感染疾病等

17、。除可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其他化合物的毒性，为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。hsieh4041等将受前列腺特异性抗原启动子调控表达萤光素酶转基因小鼠（spsaluc），与前列腺癌转基因模型小鼠tramp杂交，经检测筛选得到的子代小鼠trampluc随前列腺特异性抗原的表达稳定产生萤光素酶。因此，该小鼠借助在体生物发光成像技术已被成功地用于前列腺癌的发生及转移研究。 3在体生物发光成像技术的发展趋势 近年来针对生物发光成像过程的三大要素，即萤光素酶、底物、成像设备的研究不断取得新进展。研究人员应用遗传学手段，在基因、蛋白水平对各种

18、萤光素酶的分子结构进行改造，获得了新的萤光素酶，使底物发光的波长发生明显的红移（使发光波长变长）从而减少了光穿透机体组织时的光吸收，提高了萤光素酶在哺乳动物细胞中表达的稳定性，改变了酶在组织细胞中的半衰期。与原先的天然萤光素酶相比，通过改进得到的各种萤光素酶在体内表达的稳定性、催化底物的反应等方面得到了优化，不仅增加了发光输出量，更能适应不同时程的成像方式4246。各种萤光素酶与体内不同组织对应着独特的动力学特征。研究人员试图通过优化发光底物转入体内的方式、底物在体内的释放方式、对细胞内底物摄入相关蛋白加以限制，以及对底物本身的结构加以改造等手段，来满足体内不同时程生物过程的动态性研究。kheirolomoom等47分别用长循环脂质体和温度敏感型脂质体包裹萤光素并转入体内。前者萤光素酶以一定水平正常表达时发光完全依赖于体内萤光素的释放。今后，通过选择合适的包裹材料（如设计合理的脂质体）或其他运载方式（如