植物基因组DNA的提取及其定性定量分析

1、分子生物学实验报告实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】通过本实验学习利用 CTAB法从植物组织中提取 DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在咼离子强度 下（大于0.7 M NaCI），与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研 磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝

2、胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小 的DNA分子比分子量大的 DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒 DNA（cccDNA）泳动最快，其次为线状DNA（L DNA

3、），最慢的为开环质粒 DNA（ocDNA）。核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50卩g/mL, ssDNA 33卩g/mL和ssRNA 40卩g/mL可以此来计算 核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0,则 可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】一、仪

4、器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器（10、100、1000 uL量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷（Tris）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、3巯基乙醇、氯仿、苯酚、 乙醇、氯化钠（NaCI）、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸 （EDTA）、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、 核酸染料。三、试剂1. 2 CTAB buffer【1】2. 70%乙醇十s3. R

5、NaseA 天根）一【4】4. 0.5 X TB缓冲液（工作浓度）【5】5. 6 X loading buffer6. 核酸染料（赛百盛）7. DNA marker DL 2000（Takara）一【6】8. 酚/氯仿（1:1, V/V）【实验步骤】1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2. 加入0.6 mL 2 CTAB提取液（用前加入 0.2%的巯基乙醇），混匀，65 C水浴30 min ,每10 min颠倒混匀一次。3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀。4. 11,500 rpm室温离心8 min（若没离好可重

6、复一次）。5. 将上清液（约400 uL转移到另一新的1.5 mL离心管中。6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀， 11,500 rpm离心8 min，取上清（约350 yL。7. 加入600无水乙醇，上下颠倒混匀，-80C放置30 min。8. 4C, 15,800 rpm 离心 20 min，弃上清。9. 1 mL 70 %乙醇（预冷）洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能 vortex , 7,000 g离心3 min ,弃上清，风干。10. 加入 30 无菌水（含 20 卩 g/mL RNase A）37C 溶解 DNA 30 min。11. 取5卩L DNA品进行琼脂糖凝胶电泳检测：（1）制

7、备琼脂糖凝胶称取0.3 g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5 XTBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（2）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 待琼脂糖凝胶液冷却到 60 C左右时，加入核酸染料1.5 uL摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。 加入0.5

8、 x TB电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。（3）加样在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X用10卩微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。（4）电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过 5V/cm。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶

9、前沿1-2cm处，停止电泳。 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。12紫外分光光度法测定 DNA浓度及纯度：用0.1 x T对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现in strume nt Ready ”时，进入核酸测定窗口。（3）调零。先用0.1 x Tg冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“ set re键,”仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。（4）吸70 uL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5-7 u的石英样品杯。点击

10、“enter键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260nm和280 nm 处的光密度（OD值）及 A260/A280 nm 和A280/A260 nm 的比率以及 DNA样 品的浓度等。（5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。（6）DNA纯度：以A260/ A280比值来反映。当 A260 /A280比值1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE溶解后再测定。当 A260/A280比值2.0，说明样品存在 RNA污染，可以用 RNA酶处理样品去除

11、RNA。实验结果与分析1. 1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组 DNA1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 DNA5u样品，电泳结果如图所示c组电泳结果如图所示有DNA条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组DNA。2.DNA样品的0D检测检测0D值C1:浓度:1061.7 ng/OD260/OD280 : 1.88表明：C1接种DNA质量良好。（如下图所示）C2:浓度:1017.6ng/OD260/OD280 : 1.86表明：C2接种DNA质量良好。（如下图所示）C3:浓度:711.0ng/OD260/OD280 : 1.86表明：C3接种DNA质量良好。（如下图所示）:為矗I嗣如pr.

12、t*- mm听沁nSamp 世 O145000Qvokm:205nm 5 OBALSample C)gf.f g W12A2別门QmmpJtfi) 忸渤in 10 rfiin注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中;2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。实验二 PCR扩增目的片段【实验目的】通过本实验学习 PCR反应的基本原理与实验技术。【实验原理】聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天

13、然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热 DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步： 变性，加热使模板 DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段；退火，快速降低温度至 50-60 C后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段； 延伸，溶液反应温度升至 72C，耐热DNA聚合酶以

14、单链 DNA为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的 4种脱氧核苷三磷酸 （dNTP），按5 “ 方向复制出互 补DNA，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 0L、200卩LPCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、

15、量筒、点样板或 parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA模板1 ng/以实验一 提取的拟南芥基因组 DNA为模板）3. dNTP Mix （Takara）4 引物P3：5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5：5 -ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液浓度：2卩M5. rTaq 酶 5 U/ (iL6低熔点琼脂糖【7】7.去离子水或 TE ( pH7.6)【实验步骤】1. 在200卩L PCR管内配制20卩反应体系:ddH2O11.31

16、0 XCR缓冲液2.0dNTP1.6 （终浓度 20 200 yM引物12.0 （引物终浓度 0.2 yM引物22.0 （引物终浓度 0.2 yM反应物体积/ yL模板DNA1.0rTag 酶0.1Total20视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。3. PCR反应热循环程序设置：94 C预变性3 mi n;94 C变性30 sec;64 C退火30 sec;30 cycles72 C延伸1 mi n;72 C延伸10mi n;16Cpause反应结束后短暂离心，置 4C保存备用。4.配制1