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1、精品文档蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷 数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上 带电表面和反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879 年He

2、lmholz 提出平板型模型； 1910 年 Gouy 和 1913 年 Chapman 修正了平板型模型， 提出了扩散双电层模型；后来 Stern 又提出了 Stern 模型。根据 O. 斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层 （或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层 （或称滑移面） 。由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远， 过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。精品文档精品文档紧密层： 溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德

3、华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。滑动面： 指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为电势。固体颗粒带电量的大小及测量方式？电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。电势的大小由Zeta 电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。 一般来说，以 pH 值为横坐标，Zeta 电位为纵坐标作图，Zeta 电位为零对应的pH 值即为等电点。对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1 100 微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团， 这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用

4、，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性； 又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚， 成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH 值有很大关系， 蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH 3+ 而带正电，在碱性溶液中羧基形

5、成-COO -而带负电：蛋白质分子所带净电荷为零时的pH 值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH 的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的 pH 称为该蛋白质的等电点。等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。精品文档精品文档在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加， 所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低， 且溶液变混浊。蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白质等电点的测定各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的

6、较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.74.8 ，血红蛋白等电点为6.76.8 ，胰岛素是5.35.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH 12.012.4 。本实验采用蛋白质在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH 值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。等电聚焦电泳（IEF ， isoelectric focusing electrophoresis）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳

7、时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的 pH 处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷） ，形成一个很窄的区带。IEF的基本原理在 IEF 的电泳中，具有pH 梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH 位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH 恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH 梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时

8、间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH 位置上，形成分离的蛋白质区带。沉淀反应： 蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。主要的沉淀现象有（1）盐析：在蛋白质水溶液中加入足量的盐类（如硫酸铵），可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分离与初级提纯。（ 2）变性：在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下， 引起蛋白质某些理性质改变和生物学功能丧失。这是一个不可逆过程。（ 3）加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时间内是可逆反应； （ 4）加入生物碱

9、试剂（含氮的碱性物质） ：能使生物碱沉淀或作用产生颜精品文档精品文档色反应的物质，称为生物碱试剂。当溶液的pH 小于 PI 时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分，常温下在水中可溶解0.81.2%，微溶于 25 度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分。当浸入水中则迅速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。构造极为复杂，没有确定的分子式。分子量约为57000375000，在牛奶中约含3%，占牛奶蛋白质的80%。三、器材及试剂：1器材：试管 1.5厘米（ 9）。吸管 1 毫升（ 2）， 2 毫升（ 2），10 毫升（ 2）。容量

10、瓶50 毫升（ 2），500 毫升（ 1）。试管架。2试剂： 0.01mol L-1 醋酸溶液。0.1mol L -1 醋酸溶液。 1 mol L -1 醋酸溶液。 1 mol L -1 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。酪蛋白。四、操作步骤：1制备蛋白质胶液（ 1）称取酪蛋白 3 克，放在烧杯中，加入 40的蒸馏水。（ 2）加入 50 毫升 1 mol L -1 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到 500 毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。（ 3）在容量瓶中再加入 1 mol L-1 醋酸溶液 50 毫升，摇匀。（ 4）加

11、入蒸馏水定容至500 毫升，得到略现浑浊的，在0.1 mol L -1NaAC 溶液中的酪蛋白胶体。2等电点测定按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。精品文档精品文档蛋白质mol L-1mol L-1mol L-1观察管H2O0.010.11胶液HACHACHACpH010 分20 分号(毫升 )(毫升 )(毫升 )（毫升）（毫升）分钟钟钟0.62118.381.255.9217.755.6318.750.255.3418.500.505.0518.004.7617.001.004.4715.002.004.1811.004.003.8917

12、.403.58.001.60观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+， +， + ，表示浑浊度。3. 蛋白质性质实验（ 1）蛋白质的盐析在试管里加入 12 毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸铵饱和溶液，观察现象，有无白色浑浊产生。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。（ 2）蛋白质的变性在试管里加入2 毫升蛋白质的水溶液，沸水浴加热5 分钟，观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。在试管里加入3 毫升蛋白质的水溶液，加入1 毫升硫酸铜溶液，观察现象。（有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生） 。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。五、思考题1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本实验中，酪蛋白质在等电点时从溶液中沉淀析出，所以