组织RTPCR注意事项

1、1. 抽提rna都是为了得到其mrna，而mrna和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取rna前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。研磨要充分，使组织块变小。3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上进行。我做过大鼠下丘脑组织的rt-pcr，在动物房将组织取好先放在rnafree的ep管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的70冰箱内，在抽rna的时候

2、，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善rna抽提的质量。用生理盐水或pbs冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提rna的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。如果试剂盒没到，那就直接放在ep管中，提rna的时候再拿出来再加也可以。就是组织可能会不容易撵碎一些。我觉得你可以用高压过的edpc处理的水进行清洗（23次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与rna提取方法相关，我用的是trnzol法，一般取50100mg，）于ep管中，直接放到80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出

3、提取rna即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好depc处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。5.直接原组织冻存。本实验室做过人子宫内膜fgf基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总rna。因为我们的目的是pcr出目的基因，因此并不要求材料100的纯净，只要引物正确，反应条件合适一般能克隆出目的基因。例如：从猪肝脏中提取总rna（本人实验经验）：采用trizol试剂从新鲜猪肝脏组织中提

4、取总rna。将液氮冻存的新鲜猪肝脏组织约50mg放入ep管中，用研磨杵迅速研磨，然后加入1ml trizol试剂室温裂解5min。然后10000r/min，离心1min，将上清液转移到另一新的ep管中,加入200l氯仿轻轻混匀，室温静置3min。4，12000r/min，离心10min，转移上层水相至另一新的ep管中，加入0.5ml异丙醇混匀，室温静置5min。4，12000r/min，离心10min，可以看到白色的rna沉淀贴于ep管底部，弃上清后用75%的乙醇洗涤，真空干燥后用100ldepc处理过的ddh2o溶解rna沉淀。含有rna的溶解液立即反转录，剩余部分零下70冻存。另外我用过r

5、na提取试剂盒效果也很好，方便，快速，纯度较高组织匀浆器械：depc水处理的匀浆器，一次性换药包，一次性刀片，depc水处理枪头，电动匀浆器1.新鲜或冰冻组织用蒸馏水冲洗除去表面污物切下1mm(3)组织块2.将组织放入1。5ml的试管底，试管配有研棒3.加入1mltrizol4.插入研棒研磨碎组织块，旋转研棒将组织挤压在使馆壁上，10次左右（电动12次）5.因标本已匀浆话，将匀浆管至于4度冰桶中提取组织rna提取rna提取组织rna的准备事项1。准备depc泡的枪头，以及depc泡的匀浆器2。用depc配制的1*pbs清洗组织3。准备depc水配制的75%的酒精，泡制手术器械。带者酒精在火上燎

6、一下。4。器械：离心管2支，吸管4个，酒精灯，打火机，记号笔，200ul,1000ul枪，depc泡过的枪头ep管，紫外照过的手套。滤纸，depc纯水（750ml无水乙醇150mldepc水,剧烈振荡，使劲的摇晃，直至混匀），氯仿，75酒精，异丙醇，trizol，预冷的离心机（两种），ep管架（洗液擦洗）,手套，灭菌剪刀，镊子（2个），冰桶，冰块，高灵敏度称量仪1.将组织取出后用眼科剪剪成1mm3左右的小块2.组织样品按50100mg/mltrizol加入trizol(组织体积不能超过trizol体积的10，否则匀浆效果不好，（此时可预冷另一个离心机），研磨10次左右（剩余的组织至于冰桶中，最

7、后存于液氮中3.4度，12000g离心去除不溶物(匀浆得时候最好将匀浆器放置在冰水中以免发热)4.带双层手套，混合好的样品全部移置到0.1ml的ep管中，室温1530度静置5分钟5.加入0.2ml氯仿/1mltrizol,盖好ep管，剧烈振荡（上下颠倒），15秒钟，室温静置23min6.28度，离心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）7.上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次（用200ul枪加小心），室温静置10min7. 2-8度离心，10500rmp/min,10min,弃上清8. rna洗涤：7

8、5酒精（这次用的100。未影响）1ml沉淀，轻轻弹其底部（直接放入70度冰箱可以长期保存，静置几秒钟9 28度离心，8500rpm/min,5min ,弃上清10 取出滤纸，将ep管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）11. depc水溶解（30ul,可变），分装,2ul电泳，2ul比色，其余5ul分装至于手套中冻于20度中大概量为组织（ugrna/mg组织）：110ug28s是18s亮度的两倍（晾干时间过长会使rna降解）根据我抽提的经验，当提取组织rna时一般都有白色沉淀，当细胞量多的时候也可以看到少许，不应该是蛋白质。用酒精洗涤两次比洗一次好，然后等到差不多完全透明以后

9、再加depc水溶解，可以放四度冰箱过夜，然后比色。最好比色1.82.0，一般1.70以上都可以逆转录，没问题的。据我提取rna的经验，一般在加入异丙醇并离心后都会在管底部看到一抹带状的白色沉淀，量不会很大，如果很大的话，预后并不乐观，蛋白污染而且严重降解。如果提取材料量少的话，也有看不到任何东西的情况，我就会弃之增大样本量，因为肉眼看不到的话，即使有也有限。而且我一般会在提取总rna以后，跑胶看看提取的质量，有无降解，有无dna污染，然后定量后才做rt的。所以我认为你应该适当增加提取的细胞数。1.trizol：无论保存还是使用的时候都不要摇动，因为我们使用trizol提取rna实际利用的是异硫

10、氰酸胍/苯酚法，苯酚很容易被氧化，所以不要摇动，使用时也要从最底层吸取，也就是避免破坏表面的保护层。2.标本保存：提取组织rna时涉及保存标本的问题，现在有一种样品储存液，其中含有rnase抑制剂，可以帮助保护rna，当然仍需低温.另外还可以将标本浸在trizol里，70或20即可。3.减少dna污染：可以适当多加一些trizol4.晾干：75酒精洗涤rna沉淀后，需要晾干。建议75酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边，这样液体挥发的比较快2.4.晾干：75酒精洗涤rna沉淀后，需要晾干。建议75酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边，这样液体挥发的比较快 我认为第四步有点问题，原理和操作都有问题！通常我这么来

11、晾干，1、尽量吸干75的乙醇；2、5000rpm短暂离心；3、再次用黄色tip头吸干，尽量吸干液体4、自然风干5min，绝对可以做以后的实验了！3.其实trizol的工作容量是有一定限度的，当蛋白质特别丰富的时候，有的时候蛋白质不能全部沉在中间层，可以把上清提出来，用trizol重新提取，（充分振荡，加氯仿）把蛋白质逐步去处。也可用酚氯仿反复抽提。需要特别指出的是，本人更推荐单独用酚充分振荡，然后再加氯仿，不提倡酚氯仿提前混在一起。我刚做过肝肺的。结果很不错。（斑竹给我加分鼓励我啊）一、组织抽提：1. 取组织块60左右，加入400600ul的trizol用匀浆器撵成浆液状。2. 然后移到1.5

12、ml的ep管中，加入剩余的trizol，最终trizol的量为1ml。3. 冰上孵育5分钟5. 离心12,000g 4 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管。注意取组织块不要太多。太多反而效果不好。我们这么做出来的od值都在1.9左右。后面的步骤就和做细胞的rt-pcr一样了。在反应体系中加入bsa（10100ug/ml）可屏蔽有害物质对pcr的抑制作用，提高扩增成功率。我们的方法如下：1、取材时，最好预先准备好去rna酶的水或生理盐水，组织取下后，用rna酶的水或生理盐水冲洗干净；2、器材最好200度干烤2小时，塑料制品用0.1depc水浸泡过夜，烤干后高压；3、我们一般放在液氮里，如果不

13、方便的话，可以从液氮里转到-80度冰箱。1各种器械一定要高温（180度4小时或200，2小时）烤，取材用的玻璃器皿，锡箔纸，最好都烤过。2塑料制品泡depc，高压后（去除残留的depc），烤干。3，操作时动作迅速，戴帽子口罩手套该是常识吧。4尽量用新鲜组织。非要保存当然要液氮，保存时间不宜过长。我们实验室用的只是普通高压过的器械，也没有什么问题。不放心的话，可以用depc泡一下再高压，至于tip头还是泡一下，安全起见，但我同学提的时候从不用depc 也照样能提出来啊，他们说新的包装里面一般没有污染的，但装入盒时一定要带口罩阿如何去除rna酶外源性来源1.被污染的缓冲液2.自动移液装置应采取的措

14、施1.当处理rna酶时保证自动移液器专用2.将要用到的用于rna试验的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液留出来专用3.分成小份保存溶液或缓冲液并在用后丢弃。不用已经在试验室用于其他目的的材料或储存液4.留出专门用于分离rna的电泳装置。用清洁剂清洗后再用流水冲洗，乙醇清洗干燥后加入3的h2o2。室温10分钟后用depc处理过的水彻底冲洗电泳槽5.准备所有的溶液和缓冲液时，使用无rna酶的玻璃器皿、depc处理过的水，用于rna的化学用品用一次性刮刀或直接敲击瓶底分离。可能的化，用0.1的depc在37处理溶液至少1小时后在15pis（1.05kg/cm2）高压蒸汽灭菌15分钟6.灭菌的玻璃器皿和塑料制

15、品不能有效灭活rna酶。300烘烤玻璃器皿4小时。用depc活其他灭活基于接触的rna酶的商业化产品处理塑料制品7.用声誉好的厂家证明无rna酶的一次性移液器头和微量离心管。为了减少污染的机会，当从原包装去除这些小的器皿放在实验室架上时最好用无菌的镊子8.在分离rna的过程中用抑制剂以抑制rna酶的活性1 注意无酶操作，包括戴手套，口罩，ep管最好用depc水泡后高压。2 操作迅速，留取标本后尽快液氮冷冻保存或冻后放入-70度冰箱保存。使用专门处理过的冷冻管，进口的为佳。手套一定要戴，器械高温（300）消毒，标本液氮保存。组织液氮冻存后短时间内提取rna，再将rna -70度保存，可行吗？rn

16、a在-70度能保存多久？另一个问题，组织在-70度能保存多久？有个博士说她的组织在-70度保存一段时间后抽不出rna了，建议一直保存在液氮内。rna要想保存的时间长，最好保存在甲酰胺里面，用的时候再纯化了使用。或者提取的时候到用75乙醇洗涤时停止，将rna沉淀保存在75乙醇（depc水配置）里面，放在20度冰箱，一年应该没有问题。要用新鲜的组织,至少也是用液氮处理后保存于-70度冰箱的组织.对于刚进实验室的研究生可能一片茫然，为了节省大家的时间，向大家介绍一下rtpcr所需的实验耗材及试剂。 首先，必须设计目的基因引物和内参照引物(或试剂盒自带）。 此时，你需下列产品： 1.depc 用纯水按

17、0.1%浓度配制 2.tip 10ul 200ul 1ml 3.ep tube （1.5ml） 4.tip box（10ul 200ul 1ml） 5.ep box（1.5ml） 6.pcr tube（200ul或500ul） 7.pe手套 将耗材及器皿等放入depc水中浸泡过夜，第二天高温高压灭菌，烘干，待用。 购买total rna试剂盒先做抽提rna的预实验，也可将抽提样品的rna于低温保存。最好现提现用。 引物合成好后，就可以做rt-pcr啦。 由于pcr的反应条件相对不好掌握，推荐二步法rt-pcr试剂盒(对于新手）。可以大大降低试剂盒成本。 rt-pcr产物出来后，接下来的工作就是

18、agarose电泳，需要下列试剂：1.agarose 2.eb 3.dna marker 4.tris.base 5.edta 以上所述可根据个人具体情况作相应的调整。希望能给广大战友带来方便。最好是新鲜的,不就再买只大鼠嘛!另外,脑提rna和用细胞提差不多,很容易:取出脑组织后放到研钵里,加rna提取试剂,(不用加液氮),研之,不象其它组织,脑比较易碎.我做过大鼠下丘脑组织的rt-pcr，在动物房将组织取好先放在rnafree的ep管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的70冰箱内，在抽rna的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善rna抽提的质量。1.抽提rna都是为了得到其mrna，而mrna和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取rna前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。研磨要充分，使组织块变小。3.加入trizo