第四章 DNA的复制

1、DNA的复制 DNA Replication 讲授：陈友 生物科学与技术学院生物科学与技术学院 2014/3/242014/3/24 1 19 95 51 1年年，沃沃森森到到克克里里克克所所在在的的卡卡文文迪迪什什实实 验验室室，在在威威尔尔金金斯斯等等的的X X射射线线衍衍射射分分析析资资料料的的基基 础础上上，于于1 19 95 53 3年年提提出出D DN NA A双双螺螺旋旋分分子子结结构构模模型型 1 19 96 62 2年年获获诺诺贝贝尔尔生生理理学学或或医医学学奖奖 生命的遗传实际上染色体生命的遗传实际上染色体DNA自我复制的自我复制的 结果，染色体结果，染色体DNA的自我复制

2、主要通过半的自我复制主要通过半 保留复制来实现的，是一个以亲代保留复制来实现的，是一个以亲代DNA分分 子为模板合成子代子为模板合成子代DNA链的过程。链的过程。 亲代亲代DNA必须以自身分子为模板来合成新必须以自身分子为模板来合成新 的分子，准确地复制成两个拷贝，并分配的分子，准确地复制成两个拷贝，并分配 到两个子代细胞中去，才能真正完成其遗到两个子代细胞中去，才能真正完成其遗 传信息载体的使命。传信息载体的使命。 教学重点教学重点 DNA复制的相关概念，特点。 参与复制的主要物质及其作用 教学难点教学难点 DNA聚合酶和结构与功能 DNA复制的起始、延伸和终止（以E.coli为例） 问题：

3、 1、复制可以随机起始吗？ 2、复制是单向的还是双向的？ 3、新生链合成的方向是从5to 3 还是还是3 to 5，还是两个方向均可？，还是两个方向均可？ 4、复制时两条链是完全解开吗？ 5、两条链是同时进行复制的吗？ 是指以亲代是指以亲代DNADNA为模板合成子代为模板合成子代DNADNA的的 过程。即遗传物质的传代。过程。即遗传物质的传代。 复制复制 亲代亲代DNA 子代子代DNA 复制复制(replication)(replication) 一、DNA复制的一些概念 复制子复制子（replicon） 复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每 个

4、复制子都有控制复制开始的复制起点（个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin） 以及终止复制的终点（以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和）。任何起点和 终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。 在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。 复制起点复制起点：复制子有控制启动复制的元件，称为：复制子有控制启动复制的元件，称为 复制起点复制起点(origin of replication)，常用，常用ori来表示；来表示； 可以起始一个复制循环，并可控制复制起始反应可以起始一个复制循环，并可控制

5、复制起始反应 的频率。的频率。 复制终点复制终点：控制终止复制的元件，称为复制终点控制终止复制的元件，称为复制终点 (termini); 复制叉复制叉（replication fork）：）：DNA复制时在复制时在 DNA链上通过解旋、解链和链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过蛋白的结合等过 程形成的程形成的Y字型结构称为复制叉或字型结构称为复制叉或生长点生长点 （growing point）。在复制叉处作为模板的双。在复制叉处作为模板的双 链链DNA解旋，同时合成新的解旋，同时合成新的DNA链。链。 DNA复制首先将双螺旋复制首先将双螺旋DNA解旋，这一过程需要解旋，这一过程需要 特异的

6、拓扑异构酶或解旋酶；特异的拓扑异构酶或解旋酶；DNA的复制至少需的复制至少需 要要20多种酶和蛋白质结合在复制叉部位，形成复多种酶和蛋白质结合在复制叉部位，形成复 杂的复制体结构。杂的复制体结构。 半保留复制半保留复制在复制过程中首先两条亲本链之间的氢 键断裂,双链分开，然后以每条亲本链（parental strand）为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)， 由DNA聚合酶催化合成新的互补子链（daughter strand）。复制结束后，每个子代DNA的一条链来自 亲代DNA，另一条链则是新合成的,并且，新形成的两 个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。 这种复制方式称为

7、半保留复制(semiconservation replication)。 1958年Meselson和Stabl用实验证明了DNA复制是半保留式的。 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T

8、 G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链母链DNA 复制过程中形成的复制过程中形成的 复制叉复制叉 子代子代DNA 半保留复制半保留复制 半不连续复制半不连续复制 由于由于DNA双螺旋的两条是反向平行的，因双螺旋的两条是反向平行的，因 此在复制叉附近解开的此在复制叉附近解开的DNA链一条是链一条是5-3 方向，另一条是方向，另一条是3-5方向方向. DNA聚合酶活性是使聚合酶活性是使DNA链沿链沿5-3方向延方向延 申，所以就决定了前导链的复制是连续的，申，所以就决定了前导链的复制是连续的， 而滞后链的复制是不连续的。因此称为而滞后

9、链的复制是不连续的。因此称为 DNA的半不连续复制。的半不连续复制。 1、前导链（、前导链（leading strand） 以以5 -3 方向连方向连续续合成的合成的DNA 链链 2、滞后链（、滞后链（lagging strand） 总总体上体上沿沿着着3 到到5 方向方向延伸延伸，但但以以小小片段形式片段形式(5 -3 )不不连连 续续合成，合成，最最后共价连接后共价连接起来起来 3、冈崎片段（、冈崎片段（Okazaki fragment） 在在非连非连续续复复制制中产生的中产生的短短片段，片段，随随后后被被连接连接成成完完整的链整的链 E.coli 1000-2000nt 真核生物真核生物

10、 100-200nt 解链方向解链方向 半不连续性复制半不连续性复制（复制叉）（复制叉） 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 领头链、前导链领头链、前导链 ( leading strand )( leading strand ) 随从链、滞后链随从链、滞后链 ( lagging strand )( lagging strand ) 冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragment） 二、复制方向 1 1、相向复制（腺病毒）、相向复制（腺病毒） 2 2、单向复制（质粒、单向复制（质粒ColE1 DNAColE1 DNA 3、双向复制 D D NN A A 复复 制制 的的 几几 种种 主主

11、 要要 方方 式式 原核生物的染色体和质粒原核生物的染色体和质粒 l噬菌体噬菌体复制后期、复制后期、X174X174、 T4T4等噬菌体以及爪蟾卵母细胞等噬菌体以及爪蟾卵母细胞 的的rRNArRNA基因等。基因等。 l线粒体；叶绿体也采取此种方线粒体；叶绿体也采取此种方 式，但双链环两条链的起点不式，但双链环两条链的起点不 在同一位置。在同一位置。 三、复制速度三、复制速度 真核生物复制叉移动速度为真核生物复制叉移动速度为13kb/min， 细菌细菌DNA复制叉的移动速度为复制叉的移动速度为50kb/min， 相差相差2050倍；倍； 真核生物染色体在全部复制完成之前起点真核生物染色体在全部复

12、制完成之前起点 不再重新开始复制，而在快速生长的原核不再重新开始复制，而在快速生长的原核 生物中，起点可以连续发动复制。生物中，起点可以连续发动复制。 1）引物(primer)：复制需要一小段RNA作引物 2）模板(template)：解开成单链的DNA母链 3）底物(substrate)或称原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4）能源：需ATP供能，原料dNTP本身也是高能化合物 5）酶和蛋白质因子：DNA聚合酶(polymerase)等 四、参与四、参与DNADNA复制的物质及作用复制的物质及作用 RNA引物（引物（RNA primer） 与与一一条条DNA链配对链配对的的短短序

13、列序列(通常通常是是RNA)， （1）RNA引物可以提供引物可以提供3-OH末端作合成新末端作合成新DNA链起点；链起点； （2 2）提高了）提高了DNA复制的准确性。因为复制的准确性。因为DNA复制开始时掺入的复制开始时掺入的 核苷酸往往容易出错，加在核苷酸往往容易出错，加在RNA引物中可以被切除，不会影引物中可以被切除，不会影 响响DNA复制复制的准确性。的准确性。 问题：为什么需要有问题：为什么需要有RNA引物来引发引物来引发DNA复制呢复制呢? 参与参与DNA复制的蛋白质复制的蛋白质 1. DNA解旋酶（解旋酶（DNA helicase） 作用：解开双链作用：解开双链 2. 单链结合蛋

14、白（单链结合蛋白（single strand binding protein, ssb） 作用：防止单链退火作用：防止单链退火 （在原核细胞中表现出协同效应）（在原核细胞中表现出协同效应） 3. 引发酶（引发酶（primase） Dna G (E. coli ) 引发体引发体 Primosome 4. DNA连接酶（连接酶（DNA ligase） 需要能量需要能量 NAD（E. coli ）/ ATP（真核）真核） 5. DNA螺旋酶（螺旋酶（DNA gyrase）- 拓扑异构酶拓扑异构酶 断裂双链断裂双链 引入负超螺旋引入负超螺旋 （swivel function) 需要需要ATP 6. D

15、NA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase, Pol） Three DNA Polymerases （E. coli） （1）Pol I DNA聚合酶聚合酶 3 5 核酸外切酶（校对）核酸外切酶（校对） 5 3 核酸外切酶（损伤修复、去除引物）核酸外切酶（损伤修复、去除引物） 缺口填充缺口填充 （大缺口（大缺口） DNA 损伤修复损伤修复 缺刻平移缺刻平移 Nick translation（去除引物）去除引物） （2）Pol II 活性很低，不是活性很低，不是DNA复制必需的，复制必需的，主要起修复的作用主要起修复的作用 （3）Pol III 3 5 核酸外切酶核酸外切酶 （校对）（校对

16、） 亚基亚基 DNA聚合酶（必需）聚合酶（必需） 亚基（亚基（dna E） 缺口填充（小于缺口填充（小于100bp） （4）. Pol 和和是是19991999年发现，它们能在年发现，它们能在DNADNA损伤部位继续复制损伤部位继续复制 讨论： 1、Pol I and III功能上有哪些相同点？功能上有哪些相同点？ 2、 Pol I and Pol III功能上有哪些不同？功能上有哪些不同？ 1 以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成为底物催化合成DNA 2 需要模板需要模板( (3 5)和引物的存在和引物的存在 3 不能从头合成新的不能从头合成新的DNA链（链（必须有

17、必须有3 -OH末端末端） 4 催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端 5 催化催化DNA合成的方向是合成的方向是5 3 6 有有 3 5 核酸外切酶活性（校对功能）核酸外切酶活性（校对功能） 1 1、PolPol I and I and PolPol III III相同的功能特点：相同的功能特点： 1 5 3核酸外切酶活性不同。核酸外切酶活性不同。 2 Pol I 可进行缺刻平移、去除引物。可进行缺刻平移、去除引物。 3 二者聚合酶活性不同，二者聚合酶活性不同，Pol III是是大肠杆菌大肠杆菌 DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。复制中链延长反应的主导聚合酶

18、。 4 Pol I 主要功能是进行主要功能是进行DNA 损伤修复。损伤修复。 2、Pol I and Pol III不同的功能特点： Composition of E. coli DNA Polymerase III Holoenzyme SubunitFunctionSubassemblies DNA polymerase 3- to 5- exonucleaseCore Stimulates exonucleasePol III Dimerizes core Binds complex Binds ATP Binds to PolIII Binds to and complex Binds

19、 to SSB( DNA-dependent ATPase ) Binds to and Sliding clamp DNA聚合酶聚合酶III 1、亚基亚基 （1）结构：）结构：环状的二聚体环状的二聚体 （2）作用：作用：“活动夹板活动夹板” 允许全酶沿着允许全酶沿着DNA滑动滑动 使全酶的持续性很高使全酶的持续性很高 2、DNA聚合酶聚合酶III-形成形成不对称的二聚体不对称的二聚体 使前导链、滞后链的合成可同时进行使前导链、滞后链的合成可同时进行 提高酶持续提高酶持续 合成能力合成能力 3-53-5外切酶外切酶 校对功能校对功能 核心酶二核心酶二 聚化聚化 组建核心组建核心 酶酶 5-35

20、-3合成合成 DNADNA的催的催 化活性化活性 夹子装配夹子装配 器，协同器，协同 亚基嵌亚基嵌 住模板住模板 DNADNA 滞后链模板形成了滞后链模板形成了 一个回环，使环中一个回环，使环中 RNA引物和冈崎片引物和冈崎片 段的合成方向与前段的合成方向与前 导链一致，以适应导链一致，以适应 双链在同一复制体双链在同一复制体 上进行复制上进行复制 3 3、回环模型、回环模型 “”型复制型复制 环状环状DNA的复制方式，即从复制起点开始，的复制方式，即从复制起点开始， 双向同时进行，形成双向同时进行，形成样中间物样中间物 环节： DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止 第二节第二节

21、 细菌细菌DNA复制复制 一一、细菌、细菌DNA复制起始复制起始 （一）复制起始复合体（一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白起始点结合蛋白) DnaB（解旋酶）解旋酶） SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶）装载解旋酶和引发酶） HU（识别并刺激识别并刺激OriC 形成开链）形成开链） Gyrase（促旋酶）促旋酶）-拓扑异构酶拓扑异构酶 （二）复制起始区的结构特点（二）复制起始区的结构特点 1 1、富含、富含AT 2 2、3 3个个13bp13bp的重复序列的重复序列-解链的位点解链的位点 3 3、4 4个个9bp9bp的重复序列的重复序列- DnaA结合位点结合位点 （三）复制起始

22、引发的过程：（三）复制起始引发的过程： 1、DNA复制起点双链解开复制起点双链解开 ，形成复制叉形成复制叉 GATCTNTTNTTTTTTATNCANA DnaA+ATP DnaB DnaC OriC （富含（富含AT） 313bp重复序列重复序列 49bp重复序列重复序列 DnaA结合位点结合位点 HU +ATP ATP 过程：过程： （1）约）约20个个DnaA结合在结合在49bp重复序列重复序列 （2）DnaA复制起始复合物使复制起始复合物使13bp重复序列变性，重复序列变性， 形成开链形成开链 （3 ）DnaB与与单链单链DNA结合（需要结合（需要DnaC帮助），帮助）， 进一步解开进

23、一步解开DNA双链，形成复制叉双链，形成复制叉 2、RNA引物的合成引物的合成 leading strand: primase（引发酶）引发酶） lagging strand: primosome 引发体（引发前体引发体（引发前体primase） 引发前体：引发前体：n蛋白、蛋白、n蛋白、蛋白、n”蛋白、蛋白、i蛋白、蛋白、 dnaB蛋白和蛋白和dnaC蛋白蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端 SSB DnaG primase DnaB helicase Pol III （ /） 引发体（引发体（primosome） Pol I、ligase 复制体（复制体（repli

24、some） in vivo 二、细菌二、细菌DNA复制延伸复制延伸 （二）二）DNA聚合反应的特征聚合反应的特征 1、DNA的聚合反应是以的聚合反应是以dNTP为底物，以为底物，以3 5 DNA为模板，按碱基配对原则在为模板，按碱基配对原则在3-OH上加上加dNTP （DNA聚合酶对碱基的选择功能）聚合酶对碱基的选择功能） 2、需二价正离子如、需二价正离子如Mg ， ， 3-OH作亲核进攻形成磷酸作亲核进攻形成磷酸 二酯键二酯键 3、链沿、链沿5 3方向延长方向延长 4、碱基互补配对，若错配则切除掉、碱基互补配对，若错配则切除掉 （一）一）DNA复制体复制体(replisome) DNA聚合酶

25、聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体 （三）防止拓扑学问题（三）防止拓扑学问题两种机制两种机制 1DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解 链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋 所中和 2DNA拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋 状态转变成松弛状态；DNA拓扑异构酶(旋转酶) 可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双 链DNA nick结合结合Pol I 引物移动引物移动 / DNA合成合成 封闭缺口封闭缺口 降解的引物降解的引物 DNA ligase （四）缺刻平移（四）缺刻平移( Nick translation)去除引物去除引物 5 5 3 3 parent progeny AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAAC