细胞培养技术总结

1、吉泰生物商城 生命科学实验室一站式采购平台 http:/ n在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常 敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物 上次细胞残留物上次细胞残留物 非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质 n需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗胶塞的清洗 塑料制品的清洗塑料制品的清洗 玻璃器皿的清洗 n包括包括浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸和和冲洗冲洗四个步骤四个步骤 n清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿

2、干净透明无油迹干净透明无油迹 不残留任何物质不残留任何物质 n浸泡：浸泡：清水浸泡，可使附着物软化或被溶掉清水浸泡，可使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，新的初次使用的玻璃器皿，生产及运输中，玻璃生产及运输中，玻璃 表面带有大量干固的灰尘，表面呈碱性及带有一表面带有大量干固的灰尘，表面呈碱性及带有一 些对细胞有害的物质等些对细胞有害的物质等 先用自来水刷洗，然后用先用自来水刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过稀盐酸液浸泡过 夜以中和碱性物质夜以中和碱性物质 再次使用的玻璃器皿，再次使用的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋常附有大量刚使用过的蛋 白质，干固后不易洗掉白质，干固后不易洗掉 用后立即

3、浸入水中，要求浸泡完全，不能留有用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有 气泡或浮在液面上气泡或浮在液面上 n刷洗：刷洗： n用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附 着较牢的杂质着较牢的杂质 n刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 n浸酸浸酸 n清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗 不掉的微量杂质；不掉的微量杂质； n浸泡时器皿要充满清洁液；浸泡时器皿要充满清洁液； n浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6小时。小时。 n清洁液，

4、常用三种：强清洁液，次强清洗液，弱清洁液清洁液，常用三种：强清洁液，次强清洗液，弱清洁液 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部 及身体裸露部分及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不 停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料 制品。配成后清洁液一般为棕红色制品。配成后清洁液一般为棕红色 n冲洗冲洗 n在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分

5、冲洗，不留污染或清洁液的残迹冲洗，不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置最好用洗涤装置 如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每 次水须灌满荡洗后倒净，最后用蒸馏水清次水须灌满荡洗后倒净，最后用蒸馏水清 洗洗3-5 3-5 次，晾干备用次，晾干备用 胶塞的清洗胶塞的清洗 n新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用 自来水冲洗，再做常规处理自来水冲洗，再做常规处理 n常规清洗方法常规清洗方法 n每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的分钟

6、（以除掉培养中的 蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗 2 - 3 次，晾干备用次，晾干备用 塑料制品的清洗塑料制品的清洗 n塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的 包装，打开包装即可用，多为一次性物品包装，打开包装即可用，多为一次性物品 n必要时用必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分 冲洗，再用冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用分钟，最后用 自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用 消消 毒毒 n细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、细胞培养的最大危

7、险是发生培养物的细菌、 真菌和病毒等微生物的污染真菌和病毒等微生物的污染 n常见原因：常见原因： n操作间或周围空间的不洁操作间或周围空间的不洁 n培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 n由于在培养过程中每个环节的失误均能导致由于在培养过程中每个环节的失误均能导致 培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格 遵守操作常规，防止发生污染遵守操作常规，防止发生污染 n热灭活：热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。 适用于细胞因子和免

8、疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处理适用于细胞因子和免疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处理 会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后有时会严重会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后有时会严重 影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 n血清中的沉淀物血清中的沉淀物 n絮状物：絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮 状物不会影响血清本身的质量。可用离心状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm，5 分钟去除，也分钟去除，也 可不用处理；可不用

9、处理； n显微镜下显微镜下“小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增 多。有些沉淀物在显微镜下观察象多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。，常误认为血清受污染。 一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量，则一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量，则 应立即停止使用，更换另一批号的血清。应立即停止使用，更换另一批号的血清。 n组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节 pHpH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分值、

10、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 n用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等 KCl0.40 g KH2PO40.06 g NaCl8.00 g Na2CO30.35 g Na2HPO40.048 g D-Glucose1.00 g Phenol Red0.01 g nPBS（Phosphate-Buffered Sallines） DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型）标准型 n称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用平衡盐溶液配制，常用浓称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用平衡盐溶液配制，常用浓 度为度为0.25% （0.1%-0.5%），搅拌使溶解

11、彻底，可置室温），搅拌使溶解彻底，可置室温 4 小时，或冰箱搅拌振荡过夜，用碳酸氢钠溶液调小时，或冰箱搅拌振荡过夜，用碳酸氢钠溶液调pH 至至 7.2 左右。左右。 n进行过滤除菌，分装入瓶中，进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用。保存备用。 冷冻保护剂冷冻保护剂 n特别注意特别注意 细胞在冷冻过程中在细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间一般不要超过冰箱内放置时间一般不要超过1 小时，以防止小时，以防止 冰晶过大而破坏细胞。也可跳过冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入这一步骤直接放入-80冰箱中，冰箱中， 但这样做细胞存活率要低一些。但这样做细胞存活率要低一些。 DMSO

12、 稀释时会释放大量热量。因此，稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，不能直接加到细胞液中， 必须事先配制。必须事先配制。 DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一本身处于无菌状态，第一 次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。保存。 避免反复冻融造成避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要 过滤过滤DMSO，必须选用耐，必须选用耐DMSO的尼龙滤膜。的尼龙滤膜。 哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存

13、 n细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机 体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁 殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细 胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。 n由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培 养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相 似，适用于研究。似，适用于研究。 n幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼 仔的脏器等更容易进行原代

14、培养。仔的脏器等更容易进行原代培养。 n体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必 须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞， 并维持细胞种的延续。并维持细胞种的延续。 n培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间 不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取 出，以出，以1:2或或l:3的比率转移到另外的容器中进行培养，即的比率转移到另外的容器中进行培养，即 为传代培养。为传代培养。 n细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，指从细胞接种到分离再培养的一段期间， 与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞可以倍增与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞可以倍