第七章 核酸提取与鉴定

1、 1 核酸的提取与鉴定 第一节 预处理 第二节 DNA的提取 第三节 RNA的提取 第四节 核酸的鉴定 概述 研究对象：研究对象：基因组基因组DNA、质粒、质粒DNA、总、总RNA、mRNA 过程：过程： 裂解：裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离破碎细胞，使细胞中的核酸游离 在裂解体系中在裂解体系中 纯化：纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，使核酸与其它杂质彻底分离， 如蛋白质、盐等如蛋白质、盐等 总原则：总原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。 鉴定：鉴定：浓度、纯度、分子量、测序浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝

2、胶电泳技术等）（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等） 1 1、植物样品、植物样品 新鲜组织新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗； （一）样品预处理（获取分散细胞）（一）样品预处理（获取分散细胞） 捣碎或剪碎；加液氮液氮研磨成粉状。 2、动物样品 新鲜样品新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、 -70/液氮低温保存）； 甲醛固定组织甲醛固定组织要先去掉甲醛； 石蜡包埋组织石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处 理。 离心，弃细胞培养液； 用缓冲液多次漂洗； 来源：来源：新鲜血液或者冻贮血液； 抗凝剂：抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸柠檬酸钠（枸橼酸 钠钠

3、 ），），不可使用肝素；肝素； 分离：分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细 胞。（血清（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）是研究肿瘤的材料之一） 3、微生物培养物样品 离心获取菌体细胞， 加缓冲液洗涤， 加缓冲液悬浮菌体细胞。 4、微生物混合样品 用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。 高速离心获取菌体细胞。 用缓冲液洗涤菌体细胞。 加缓冲液悬浮菌体细胞。 （二）提取用具预处理（二）提取用具预处理 1 1、DNADNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无 DNA酶处理。 2 2、RNARNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌，防止二次污染。 RNA易被R

4、Nase水解，RNase无处不在且 耐高温，提取条件要求严格。 裂解细胞，溶出裂解细胞，溶出DNA 除去杂质除去杂质 重新溶解重新溶解DNA 沉淀、浓缩沉淀、浓缩DNA 破碎细胞，溶解破碎细胞，溶解DNADNA： 用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。 微生物样品提取液：含表面活性剂微生物样品提取液：含表面活性剂SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等 动物样品提取液：含动物样品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等 植物样品提取液：含植物样品提取液：含CTABCTAB 核酸酶可被核酸酶可被CaCa2+ 2+、 、MgMg2+ 2+等激活，提

5、取液均含有螯合剂（如 等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTAEDTA， 柠檬酸等），螯合这些离子。柠檬酸等），螯合这些离子。 2、除去杂质（主要是蛋白质） （SDSSDS，破膜、蛋白质变性沉淀），破膜、蛋白质变性沉淀）苯酚抽苯酚抽 提蛋白质提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚氯仿抽提、萃取苯酚 经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、 中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯 仿溶液。仿溶液。 蛋白质蛋白质 苯酚氯仿苯酚氯仿 核酸溶液核酸溶液 3.沉淀DNA 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀DNADNA：2 2倍体积无水乙醇（或倍体积无水乙醇（

6、或1 1倍体积的异戊醇）倍体积的异戊醇） 再用再用75%75%乙醇清洗多次。乙醇清洗多次。 4.重新溶解DNA 将将DNADNA溶于水或溶于水或TETE溶液。溶液。 qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷，十六烷 基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除

7、蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入 冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 q SDS法原理法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下）条件下 能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋浓度并降低温度（冰浴），使蛋 白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；白质及

8、多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉 淀水相中的淀水相中的DNA。 DNA提取的一般流程提取的一般流程 三、质粒DNA的提取 质粒质粒DNADNA特点：特点： （1 1）细菌基因组）细菌基因组DNADNA以外的小型闭合环状双链以外的小型闭合环状双链DNADNA分子。分子。 （2 2）大都含有抗生素抗性基因。）大都含有抗生素抗性基因。 （3 3）可自我复制或表达。）可自我复制或表达。（重组（重组DNADNA技术中构建载体）技术中构建载体） （4 4）大小）大小1-300 kb1-300 kb。 1 1、培养细

9、菌和扩增质粒、培养细菌和扩增质粒 n 加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋 白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。 2 2、收获细菌和溶菌、收获细菌和溶菌 离心收集细菌细胞。离心收集细菌细胞。 细菌裂解方法：细菌裂解方法： 机械法机械法 化学试剂法化学试剂法 （SDSSDS） 溶菌酶化学试剂联合法（最常用）溶菌酶化学试剂联合法（最常用） 3 3、分离质粒、分离质粒DNADNA 基因组基因组DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离分离 碱裂解法（最常用）碱裂解法（最常用） 用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）

10、悬浮菌体。）悬浮菌体。 溶液溶液2 2（NaOHNaOH和和SDSSDS）裂解菌体，蛋白质与）裂解菌体，蛋白质与DNADNA发生变性。发生变性。 溶液溶液3 3中和中和pHpH，质粒，质粒DNADNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，分子能够迅速复性，呈溶解状态， 基因组基因组DNADNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。不复性与蛋白质形成絮状沉淀。 离心后，质粒离心后，质粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNADNA变性。变性。 降低温度，质粒降低温度，质粒DNADNA复性留于上清液，基因组复性留于上清液，基因组DNADNA复性很慢

11、复性很慢 与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。 煮沸裂解法（偶尔用）煮沸裂解法（偶尔用） 梯度离心法（极少用）梯度离心法（极少用） 基因组基因组DNADNA断裂，吸附大量断裂，吸附大量EBEB，密度大；质粒，密度大；质粒DNADNA密度小。密度小。 利用氯化铯梯度离心，分离基因组利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA。 离心分离后，吸取含有质粒离心分离后，吸取含有质粒DNADNA的上清液。的上清液。 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质

12、粒DNADNA（与基因组（与基因组DNADNA方法同）。方法同）。 4 4、质粒、质粒DNADNA的纯化的纯化 蛋白质蛋白质 苯酚氯仿苯酚氯仿 核酸溶液核酸溶液 （一）总RNA的提取 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除 去。 最关键的是抑制RNA酶的活性。 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的 RNARNA酶抑制剂。酶抑制剂。 异硫氰酸胍：可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认 为是最有效

13、的最有效的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂。 RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。 （1 1）提取）提取RNARNA所用器皿的处理及溶液的准备所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1 DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具 因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。 玻璃用品：玻璃用品：使用前于180的高温下干烤6h以上， 或在220下干烤3h以上。 有机玻璃的电泳槽等，有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再用3H2O2室温浸泡10min，然 后用0.1DEPC水冲洗，晾干。 所需溶液的配制：所需溶液的配制：必须用高压灭菌的

14、水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一 次性手套和口罩，应勤换手套。 （2 2）RNARNA提取中提取中RNaseRNase污染的控制污染的控制 1 1、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍- -氯化铯超速离心法氯化铯超速离心法 使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效 抑制RNA酶的活性； 再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底， 而DNA与蛋白质在上清液中。 这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞 染色体DNA。 2 2、盐酸胍、盐酸胍- -有机溶剂法有机溶剂法 利用盐酸胍使蛋白质变性

15、，抑制RNA酶； 3 3、氯化锂、氯化锂- -尿素法尿素法 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶； 氯化锂选择性沉淀RNA。 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA 会丢失一些小分子RNA。 4 4、一步快速热酚抽提法、一步快速热酚抽提法 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使 用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白 复合物的解离，使RNA与蛋白质分离； 用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙 醇或异丙醇沉淀纯化RNA。 此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品， 对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。 5 5、试剂盒快速提取法、试剂盒快速提取法 裂解液含

16、胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时 变性； 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA； 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA； 此法操作简便快速。 TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白， 核酸物质解聚得到释放。 苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、- 巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 1）实验前取冰，）实验前取冰，4离心机预冷，离心机预冷，DEPC处理水处理水（高压灭菌（高压灭菌 处理）处理）配制的配制的75%乙醇乙醇4预冷；预冷； 2）

17、1ml Trizol匀浆好的样品；匀浆好的样品； 3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，颠倒颠倒混匀（混匀（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋，氯仿使蛋 白变性白变性 4）室温室温，静置，静置3分钟分钟； 5）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心15分钟分钟；静置；静置1分钟分钟（分（分 层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相， RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中） 6）取上清取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点 也不要吸到中间层的物质）也

18、不要吸到中间层的物质）放入另一个放入另一个1.5ml的的EP管中；管中； 7）加入等体积的）加入等体积的异丙醇异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；），涡旋混匀； 8）室温室温，静置，静置10分钟分钟（该条件由（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的试剂盒提供；其他提供的 条件用条件用-20、1小时，目的为了更好分层）小时，目的为了更好分层） 9）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心10分钟分钟 10）弃上液弃上液(移液器调至移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿步，沿 液面吸弃约液面吸弃约0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸弃其余上清

19、步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触注意吸头不要接触 到沉淀斑区）到沉淀斑区） 11)沿试管内壁轻轻加入沿试管内壁轻轻加入1ml 4预冷的预冷的75%乙醇乙醇,注意切勿注意切勿 冲击到沉淀斑区冲击到沉淀斑区 12）离心机）离心机4、10000转转/分，离心分，离心5分钟分钟 13）弃上液弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒温箱干燥恒温箱干燥5分钟分钟（注意：打开管盖；或用（注意：打开管盖；或用 真空干燥真空干燥5分钟）分钟） 14）加入）加入50l DEPC处理水处理水溶解溶解（可以

20、根据管底的白色沉淀判（可以根据管底的白色沉淀判 断断RNA量的多少加量的多少加DEPC处理水）处理水） 15）-80冰箱保存。冰箱保存。 （二）mRNA的提取 从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条 件下与Oligo（dT）结合，其 他成分被洗掉，再用低盐浓 度洗脱mRNA。 （一）核酸浓度检测 OD2601时（比色皿厚度时（比色皿厚度1.0cm） 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml， 单链单链DNA或或RNA浓度为浓度为40 g/ml。 DNA(g/ml) = OD26050 RNA（g/ml ） = OD26040 （二）核酸纯度

21、检测（紫外吸收法紫外吸收法） 核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸 收峰 核酸的纯度用比值表示。 DNA样品：样品： OD / OD 1.8 ，DNA纯度高纯度高 OD / OD 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降解部分降解 OD / OD 1.8，含苯酚或蛋白杂质，含苯酚或蛋白杂质 RNA样品：样品： OD / OD 1.82.0 RNA纯度高纯度高 2.0，RNA出现降解出现降解 （三）核酸完整性检测（三）核酸完整性检测 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电 泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）， 溴化乙锭染色，紫外灯观察。 凝胶上RNA存在处可观察到

22、清晰的条带。完整性 良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度 应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。 电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 多用于鉴定较大核酸片段（0.160 kb） 聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于鉴定较小的核酸片段（501000 bp） 六、电泳六、电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的 浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓 度的琼脂糖形成较小的孔径。 琼脂糖浓度() 线型DNA分子的分离范围(kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1