大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作

1、大肠杆菌高密度发酵大肠杆菌高密度发酵 第二组 小组长：李青 小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建 贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、 郭荣欣 目录目录 大肠杆菌大肠杆菌 高密度发酵高密度发酵 培养基选择培养基选择 培养基配置培养基配置 培养方式培养方式 培养条件培养条件 操作流程操作流程 具体步骤具体步骤 参数控制参数控制 注意事项注意事项 大肠杆菌 大肠杆菌是基因工程中常用大肠杆菌是基因工程中常用 的宿主菌的宿主菌,许多有价值的多肽和许多有价值的多肽和 蛋白在大肠杆菌中已成功地进蛋白在大肠杆菌中已成功地进 行了表达行了表达,表达水平有些高达细表达水平有些高达细 胞总蛋白的胞总蛋白的30%以

2、上以上. 大肠杆大肠杆 菌作为外源基因表达的宿主菌作为外源基因表达的宿主,由由 于具有遗传背景清楚于具有遗传背景清楚,目的基因目的基因 表达水平高表达水平高,技术操作、培养条技术操作、培养条 件简单件简单,抗污染能力强抗污染能力强,大规模大规模 发酵经济等优点发酵经济等优点,倍受遗传工程倍受遗传工程 专家重视专家重视,是目前应用最广泛是目前应用最广泛, 最成功的表达体系最成功的表达体系. 高密度培养技术高密度培养技术 高密度培养技术：是应用一定的培养高密度培养技术：是应用一定的培养 技术和设备来提高菌体生物量和目标产物技术和设备来提高菌体生物量和目标产物 时空产率的发酵技术。时空产率的发酵技术

3、。 利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组 建的基因工程菌的表达产物建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量大肠杆菌的生物量, 表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以难以 获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发 酵不但可获得较高的生物量酵不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的而且可显著提高目的 基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有 较高的要求较高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。而且对发酵条件也有非常高的要求

4、。 影响高密度发酵的因素非常多影响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的如细菌生长所需的 营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧 浓度、培养温度、发酵液的浓度、培养温度、发酵液的pH 值、补料方式及值、补料方式及 发酵液流变学特性等。发酵液流变学特性等。 大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物 乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 预防措施：预防措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长 速率越高，乙酸产生越多，当比生

5、长速率超过某个值速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值 时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度， 控制补料等方法来降低比生长速率。控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析 技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实 现重组菌的高密度发酵和产物的表达。现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程 中重要的碳源之一，用其作

6、碳源是要将其控制在一个中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个 较低的水平上，以减少乙酸的产生。较低的水平上，以减少乙酸的产生。 培养基选择培养基选择 LBLB培养基培养基( (种子培养基种子培养基) :) :胰蛋白胨胰蛋白胨5g,5g, 酵母粉酵母粉2.5g,NaCl5g,2.5g,NaCl5g,溶于溶于500mlH2O,NaOH500mlH2O,NaOH调调 节节pH7.0, 2LpH7.0, 2L三角瓶装三角瓶装, ,灭菌锅湿热高压灭灭菌锅湿热高压灭 菌菌121, 20min,121, 20min,室温保存室温保存. . TB TB培养基培养基( (发酵培养基发酵培养基) : )

7、: 胰蛋白胨胰蛋白胨 240g, 240g, 酵母粉酵母粉480g, 480g, 甘油甘油80g, 80g, 消泡剂消泡剂1ml, 1ml, 溶于溶于H2O, H2O, 定容至定容至19L,B. Braun19L,B. Braun发酵罐在位发酵罐在位 灭菌灭菌121, 15min.121, 15min. 培养基配制培养基配制 配制种子固体培养基配制种子固体培养基100mL 100mL ， 分装试管，分装试管， 0.1MPa 0.1MPa 灭菌灭菌20min20min，然后摆成斜面。，然后摆成斜面。 配制种子培养液配制种子培养液600mL600mL，分装，分装50mL50mL于一个于一个 250

8、mL250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下三角瓶中（作一级种子瓶），余下 550mL550mL平均分装于三个平均分装于三个500mL500mL三角瓶中（作三角瓶中（作 二级种子用），同上灭菌。二级种子用），同上灭菌。 培养方式培养方式 微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3 3种。种。 大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工 艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中 的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一的化学环

9、境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一 方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现 象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞 的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各 样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。 培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补 料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培料是提高细胞浓度

10、和外源蛋白产量的有效方式，高密度培 养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。 培养条件培养条件 1、温度：、温度：3638 2、pH： 7 3、搅拌速率：、搅拌速率：100200r/min 4、溶氧、溶氧: 2050% 5、通风：、通风：23L/min 6、接种量：、接种量：12% 操作步骤操作步骤 1 1、菌种准备、菌种准备 2 2、上罐前的准备及实罐灭菌、上罐前的准备及实罐灭菌 3 3、发酵操作、发酵操作 4 4、发酵管理、发酵管理 5 5、发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 6 6、补料、补料 7 7、放罐、放罐 8

11、8、清洗、清洗 菌种准备菌种准备 1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，面，37培养培养24h。 2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶，瓶， 37振荡培养振荡培养12h，然后转接二级，然后转接二级 种子瓶，种子瓶， 37振荡培养振荡培养10h。 上罐前的准备及实罐灭菌上罐前的准备及实罐灭菌 1、洗净发酵罐及各联接胶管、洗净发酵罐及各联接胶管 2、 配制发酵培养基配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴，置发酵罐内，加入几滴 泡敌。泡敌。 3、校正、校正pH电极和溶氧（电极和溶氧（DO）电极。）电极。 4、把

12、电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等 固定、密封好后，开夹套出、进水阀固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1， 使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用 倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启，启 动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min， 开启冷凝水出水阀开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门，开启蒸气阀门S1，进行在，进行在 位灭菌。位灭菌。 发酵罐发酵罐 上罐前的准备及实罐灭菌上罐前的准备及实罐灭菌 5、当保护罩顶部

13、阀门、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，有蒸气排出时， 2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时， 微开阀微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀适当排气，并调整蒸气阀S1维持维持 罐温。保温结束后，关蒸气阀罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷，全开冷 凝水出水阀凝水出水阀V1，开进水阀，开进水阀W3，将温度设定，将温度设定 在在37，切入自动。，切入自动。 6、当温度降到、当温度降到100以下，缓缓开排气阀以下，缓缓开排气阀V4， 使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。 上罐前的准备及实罐灭菌上罐前的准备及实罐灭菌 7、连接通

14、气管路，将进气过滤器、连接通气管路，将进气过滤器K7口与控口与控 制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通 空气压缩机电源，空气压缩机电源， 对发酵罐进行通气，对发酵罐进行通气， 调调 整空气流量整空气流量3 5L/min。 8、当温度达到、当温度达到37时，将预先灭菌的时，将预先灭菌的pH电电 极、极、DO电极（电极（75%酒精消毒、酒精消毒、UV消毒）接消毒）接 入发酵罐，连接各电极导线。入发酵罐，连接各电极导线。 上罐前的准备及实罐灭菌上罐前的准备及实罐灭菌 9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面 板操作开关选择碱泵

15、，打开手动开关，使板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使 胶管内充满液体，将输出上限设在胶管内充满液体，将输出上限设在15%， 下限设为下限设为“0”，待一切准备就绪，将，待一切准备就绪，将“手手 动动”开关调节到开关调节到“自动自动”状态。状态。 10、设定搅拌转速为、设定搅拌转速为300r/min、空气流量、空气流量 23L/min、pH7.0、DO100%，系统进入，系统进入 发酵状态。发酵状态。 发酵操作发酵操作 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后， 进行如下操作：进行如下操作： 1 1、取样：松开弹簧夹、取样：松开弹簧夹J2J2，用无菌空气将取样

16、管残，用无菌空气将取样管残 液压入发酵罐内，再夹紧液压入发酵罐内，再夹紧J2J2，将出料管放入接料，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹瓶，松开取样管弹簧夹J3J3，发酵液被压入接料瓶，发酵液被压入接料瓶， 开开J2J2、J3J3排出取样管内残料，夹紧排出取样管内残料，夹紧J2J2、J3J3 2 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌后

17、立即进行第一次取样，用于测定细菌ODOD值。值。 发酵管理发酵管理 控制发酵过程的各项参数（温度、控制发酵过程的各项参数（温度、PHPH、溶解氧、搅拌速度、溶解氧、搅拌速度、 空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及 时排除。时排除。 每小时取一次样，每次取样每小时取一次样，每次取样50ml50ml。取样时先将空气流量计。取样时先将空气流量计 旋钮调至旋钮调至01L/min01L/min，松开弹簧夹，松开弹簧夹J2J2，用无菌空气将取样管，用无菌空气将取样管 残液压入发酵罐内，再夹紧残液压入发酵罐内，再夹紧J2J2，将出料管放入接料瓶

18、，松，将出料管放入接料瓶，松 开取样管弹簧夹开取样管弹簧夹J3J3，发酵液被压入量筒，当达到，发酵液被压入量筒，当达到40mL40mL，开，开 J2J2排出取样管内残料，夹紧排出取样管内残料，夹紧J3J3、J2J2。将样液入标记有取样。将样液入标记有取样 时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样 要及时清洗量筒。要及时清洗量筒。 每次取样前（每隔每次取样前（每隔1 1小时）记录发酵过程温度、小时）记录发酵过程温度、PHPH值、值、DODO、 通风、转速的测定数值，并记录操作情况。通风、转速的测定数值，并记录操作情况。 发酵过程中各生化

19、指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 发酵过程中，虽然能自动控制温度和发酵过程中，虽然能自动控制温度和pHpH两个两个 重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作：重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作： （1 1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控 制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。 （2 2）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰 氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有 杂菌污染。杂菌污染。 （3 3）随着培养时

20、间的延长，适当地调节进气量）随着培养时间的延长，适当地调节进气量 和搅拌转速，以维持一定的和搅拌转速，以维持一定的DODO值。值。 发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 （4 4）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含 量。测定步骤如下：量。测定步骤如下： 发酵液中糖含量小于发酵液中糖含量小于 4 4时，直接取发酵液时，直接取发酵液 0.5 ml0.5 ml于锥于锥 形瓶中，若糖含量大于形瓶中，若糖含量大于 4 4时，先稀释时，先稀释1010倍后，取稀释液倍后，取稀释液 0.5ml0.5ml于锥形瓶中。于锥形瓶中。 向锥形

21、瓶加入裴林试剂甲液和乙液各向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各 5ml5ml，混匀，加热，混匀，加热 至沸腾。至沸腾。 用用0.10.1标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖 液的体积数（液的体积数（V V）。）。 取取0.5 ml0.5 ml蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗 葡萄糖的体积数（葡萄糖的体积数（V0V0）。）。 按下公式进行计算：按下公式进行计算：(V0-V)x0.1/0.5x(V0-V)x0.1/0.5x稀释倍数稀释倍数 V0 V0 为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。为葡萄糖滴定空白时消耗的

22、毫升数。V V为葡萄糖滴定为葡萄糖滴定 样品时消耗的毫升数。样品时消耗的毫升数。 发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 （5 5）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下：）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下： 取发酵液经取发酵液经3500 r3500 rminmin离心离心 10min10min。 分别吸取上清液分别吸取上清液 2.0 ml2.0 ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各于两个磨口具塞锥形瓶中，各 加蒸馏水加蒸馏水 5ml5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入。向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7 ml7 ml蒸馏蒸馏 水，作空白对照。水，作空白对照。 向上述向

23、上述 3 3个瓶各加中性申醛溶液个瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml5.0 ml，混匀，加，混匀，加 0.5 0.5 溴麝香草酚兰液溴麝香草酚兰液 2 2滴和滴和 0.50.5酚酞液酚酞液4 4滴。滴。 用标准用标准 0.100mol0.100molL NaOHL NaOH溶液滴定至紫色，分别记录溶液滴定至紫色，分别记录 消耗的消耗的NaOHNaOH液毫升数。液毫升数。 按下式计算按下式计算: (V0-V)x1.4008: (V0-V)x1.4008 V V为滴定发酵液时消耗为滴定发酵液时消耗NaOHNaOH溶液的毫升数。溶液的毫升数。V0 V0 为滴定空白为滴定空白 时消耗时消耗NaOHNaO

24、H溶液的毫升数。溶液的毫升数。1.40081.4008为为 1ml 0.1mol1ml 0.1molLNaOHLNaOH 溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。 发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 （6）测定）测定OD值值 大肠杆菌标准曲线的绘制：取大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与离心管，与105烘烘 2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上 称重（称重（W0），精确到小数后），精确到小数后4位，然后准确取位，然后准确取10mL发酵发酵 液，于

25、液，于3000rpm离心离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，弃去上清液，用蒸馏水洗涤 沉淀，同上离心，弃上清液，与沉淀，同上离心，弃上清液，与100烘至恒重，用镊子烘至恒重，用镊子 夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精确），精确 至小数后至小数后4位，得细胞干重为位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液，稀。取同一发酵液，稀 释释2、5、10、20、50倍，于倍，于600nm下测下测OD值。以值。以0D值值 为纵坐标，菌液浓度（为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。）为横坐标，绘制标准曲线。 均匀取样品均匀取样品5mL于编号

26、试管中，用空白发酵液稀释至一于编号试管中，用空白发酵液稀释至一 定浓度，在定浓度，在721分光光度计上测定分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与，根据菌体浓度与 吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。 其余发酵液于其余发酵液于3，2000r/min条件下离心分离条件下离心分离8min,上上 清液装入编号三角瓶，用于测糖。清液装入编号三角瓶，用于测糖。 发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中各生化指标的测定 （7 7）当发酵到一定时候，光密度值达到）当发酵到一定时候，光密度值达到1 1 1.51.5，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时，发酵液中还原糖和氨基

27、氮含量较低时， 开始补料，并在发酵结束前一小时终止。开始补料，并在发酵结束前一小时终止。 （8 8）每小时记录发酵过程温度、）每小时记录发酵过程温度、pHpH和和DODO的测的测 定数值，并记录操作情况。定数值，并记录操作情况。 大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌流加发酵策略 大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株， 广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培 养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生， 因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带

28、来的高浓度 乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研 究发现，即使葡萄糖浓度只有究发现，即使葡萄糖浓度只有0.250.250.5 g/L0.5 g/L，大，大 肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所 采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保 持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最 好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可 以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于以防止底物

29、积累到毒性水平，也不会使细胞处于 饥饿状态。饥饿状态。 补料方式补料方式 采用简单反馈控制补料，又称单一循采用简单反馈控制补料，又称单一循 环法，此法控制与营养物利用相偶联的环法，此法控制与营养物利用相偶联的pHpH 或溶解氧浓度等参数或溶解氧浓度等参数, ,使之保持恒定。使之保持恒定。例如例如, 预先设定预先设定pH恒定值恒定值,发酵中菌体代谢产生酸发酵中菌体代谢产生酸 性物质或铵性物质或铵,使使pH值发生改变值发生改变,从而启动控从而启动控 制开关制开关,开始补料开始补料,pH恢复至恒定值以溶解恢复至恒定值以溶解 氧浓度作为补料开关则是根据培养基中某氧浓度作为补料开关则是根据培养基中某 种

30、关键营养物种关键营养物(主要是碳源主要是碳源)消耗消耗,会导致溶会导致溶 解氧浓度迅速改变。解氧浓度迅速改变。 溶氧控制的分批补料培养溶氧控制的分批补料培养 控制的几个关键参数如下：控制的几个关键参数如下： 1、温度：培养温度为、温度：培养温度为37 。 2、pH：自动流加：自动流加30%的氨水，使的氨水，使PH保持保持 在在7.0左右。左右。 3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流 加补料分三个阶段进行，发酵过程中加补料分三个阶段进行，发酵过程中04h 不加补料，不加补料，410h补加含补加含50g葡萄糖的补料，葡萄糖的补料， 1020h加入含加入含1

31、90g葡萄糖的补料，诱导前葡萄糖的补料，诱导前 0.5h追加追加100ml补料。补料。 放罐放罐 发酵发酵8 8小时后，测小时后，测ODOD值及还原糖量，当发酵值及还原糖量，当发酵 液的液的PHPH不断上升且为碱性、不断上升且为碱性、ODOD值增长缓慢，值增长缓慢， 且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准 备放罐。备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，放罐操作同取样。将全部发酵液取出后， 100100煮沸煮沸1010分钟灭菌，灭完菌的发酵液可分钟灭菌，灭完菌的发酵液可 排放入下水道。排放入下水道。 清洗清洗 放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵 罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五 分钟，排水。分钟，排水。 再次注入自来水清洗，操作如再次注入自来水清洗，操作如1 1。 清洗结束，关闭电源。清洗结束，关闭电源。 注意事项注意