环介导等温扩增技术

1、环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术 2015307360 吴祖雄 l定义：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链 置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60- 65恒温扩增，15-60分钟左右即可实现1091010 倍的核酸扩增。 扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶 需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循 环 l针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc区 以及5 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 lLAMP反应的开始阶段四条引物都被

2、使用，但在循环阶段则只有内引 物被使用。 lFIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成， F2区与靶基因3端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5端的Flc区域序列 相同。 lF3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶 基因的F3c区域互补。 lBIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5端的Blc 区域序列相同。 lB3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3

3、区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。 LAMP反应引物与对应模板区域反应引物与对应模板区域 l第1步：内引物FIP的 F2与其模板的互补序 列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从 F2的3末端开始启动 DNA 合成，合成一条 以FIP为起始的新的 DNA单链，并与模板链 结合形成新的双链DNA。 而原DNA双链中与模板 链互补的非模板链将 被取代而游离于反应 液中。 l第2步：原合成 的以FIP为起始 的DNA单链被置 换而脱离，成 为单链DNA，其 在5末端F1c 和F1区发生自 我碱基配对， 形成茎环状结 构。 l第3步：引物BIP的B2与模板 链B2c区互补配对，合成以 BIP

4、 为起始的新链，并与模 板链互补形成DNA双链。同 时，F端的环状结构将被打 开，外引物B3与模板上 B3c杂交后，以其3末端为 起点也开始合成新链，并使 BIP为起始的DNA单链从模 板链上脱离下来，形成以 FIP和BIP为两端的单链。 l整条链呈现哑铃状结构，此 结构即为LAMPLAMP的的基础基础结构结构. . l反应结束后，对扩增产物常进行焦磷酸镁沉淀检测（浊度 检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。 l浊度检测：在LAMP反应过程中，会产生一种叫焦磷酸镁的 衍生物。由于LAMP能产生大量的扩增产物，衍生物的产量也 会大增，于是呈现出白色浑浊。因此，通过观察白色浑浊的 有无，可验证

5、是否有靶基因存在。 l荧光检测：钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合后 处于淬灭状态。扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合 释放钙黄绿素，使钙黄绿素的淬灭状态解除，发出黄绿色荧 光。反应后加荧光染料法的优点是灵敏度较高，在直接观察 不能准确判断结果时，加入荧光染料可增加其可视性，提高 判断的准确度 lLAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避 免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的 灵敏度和扩增效率。 l操作简单：只需一个水浴锅 l快速高效：不需要预先的双链DNA热变性避免了温度循环而造成 的时 间损失 l特异性强：针对靶序列6个区域设计

6、的4种特异性引物。6个区域中任何区 域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 l高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 l缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。 500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳 性结果。 lLAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进 行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏准 确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临床 药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、病 毒的LAMP 检测法。 l流行性乙型脑炎病毒的检测：杜鹃等建立了流行性乙 型脑炎病毒一步法RT-LAMP 检测方法，对GenBank 中登录的25 株JEV基因序列进行分析，设计该基因保 守区域的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3B3， 2条内引物FIPBIP和2条环引物FLPBLP。在 LAMP反应体系中加入逆转录酶和RNA 模板，65水 浴60 min，反应可一步完成。 l犬细小病毒的检测：杨慧等建立了犬细小病毒LAMP 检 测方法，选取犬细