沈涛-M160608-甜柿果实中活性多糖的研究试验方案

1、 试验设计方案 论 文 题 目 甜柿果实中活性多糖研究方案学 生 姓 名 沈 涛 所 在 学 院 园艺与植物保护学院 专业及班级 果树学 园研1601班 学 号 M160608 完 成 日 期 2017年1月7日 甜柿果实中活性多糖的研究试验方案M160608 沈 涛 果 树 学1 选题依据：柿(Diospyros kaki Thunb.) 为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros Linn)植物，主要生长在热带、亚热带及暖温带地区，原产中国，集中分布于包括韩国和日本在内的东亚地区。近年来在亚洲其他国家，以及南美和欧洲等也有商品化生产。我国是世界上柿子的主产国之一，已有3 000多

2、年的栽培历史，栽培面积达20万hm2，随着我国人民生活水平的逐步提高及人们对果品需求的多样化，柿树在近20年来得以迅速发展。在我国北方的山西、陕西、河南、河北、山东等省柿资源都很丰富。我国长江流域气候属于夏湿带，与日本的甜柿的主要分布区综合生态因子相近似，自20世纪80年代以来，我国引种日本甜柿已从种质资源收集为主、零星种植进入到有计划的引种试验和示范推广阶段。我国甜柿生产主要有三大产区:一是以浙江省杭州地区为中心的甜柿引种老区，浙江是我国引进品种最多、栽培面积最大的省；二是以汉中盆地为中心的北方引种区，该区以秦巴山地为主，包括关中平原的北缘引种试验区;三是以云南保山市为中心的西南引种区。柿子

3、不仅营养丰富，含有大量的糖类及多种维生素，而且具有很高的药用价值和经济价值。迄今为止，各国科研工作者发现柿子中的多种活性物质，其中包括类胡萝卜素、黄酮类、脂肪酸、酚类和多种氨基酸、微量元素，可被广泛用于医药、保健和化妆品等领域。中国传统医学认为，柿子味甘、涩，性寒，归肺练。本草纲目中记载:“柿乃脾、肺、血分之果也。其味甘而气平，性涩而能收，故有健脾涩肠，治嗽止血之功。”根据其能否自然脱涩及其性状遗传特点，栽培柿品种分两大类:一类是自然脱涩表现质量性状遗传特点的完全甜柿，另一类是自然脱涩表现数量性状遗传特点的非完全甜柿。完全甜柿是在树上能自然脱涩,摘下来就可食用的一类柿树品种,其果实甜脆爽口,风

4、味独特。近年来,我国正在大量进行日本甜柿引种栽培,国内对甜柿的生物学特性和栽培技术已作了部分观察和研究。多糖(polysaccharide)又称多聚糖，由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。一般多糖都由100个以上甚至几千个单糖组成，分子量为数万到数百万，是构成生命活动的4大基本物质之一，与生命的多种生理功能密切相关。已有研究表明，多糖不但能治疗机体免疫系统受到严重损伤的癌症，也能治疗多种免疫缺损病症，如病毒性肝炎、风湿症等，甚至可以辅助治疗艾滋病和延缓衰老等。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还

5、原性和变旋现象。多糖可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。根据多糖的来源不同，一般可将多糖分为植物性多糖，动物性多糖和微生物性多糖三大类。常见的植物性多糖有淀粉、纤维素、葡聚糖、果聚糖、半纤维素、树胶、粘液质、卡拉胶等。作为水果中的一类重要结构物质与功能物质，多糖在各种水果中均大量存在。这些多糖不仅赋予果实一定的质构特性和感官品质，而且在果实病虫害防御等方面具有重要的作用，因此常常成为水果成熟度判定、贮藏加工、品质分析控制和病害防治研究中的一项重要指标。近年来随着天然活性多糖研究的深入，大量的水果多糖资源不断被发掘利用，目前己报道的水果活性多糖种类达几十种，几

6、乎涉及到所有常见水果种类。但对甜柿品种中活性多糖的研究还未见过报道，因此开展本项研究工作。2 研究目的和意义当前，对多糖的研究方兴未艾，关于多糖的生物活性、作用机制、构效关系以及结构修饰等一直是研究的重点，对于指导多糖应用开发和加速多糖产业化进程具有重要作用。水果多糖作为天然植物多糖中的一类，虽然近年来也受到了一定的关注，部分水果多糖的提取、结构与活性等得到了初步研究，但基本没有涉及水果多糖生物活性的分子机理和构效关系，远远落后于目前己在医药和保健品中广泛应用的中药多糖、食用菌多糖及海藻多糖等的研究深度和广度。这不仅使得人们不能完全理解水果的保健价值，而且也阻碍了对水果多糖资源的高效利用。随着

7、近年生活水平提高人们对健康的意识越来越强，柿子多糖具有的广泛的生物活性也被人们所认可，但对其的深入研究的文献并不多。加强对柿子多糖的研究，通过对甜柿多糖提取、分离纯化并进行甜柿多糖纯度及分子量的测定，用现代技术对甜柿多糖进行分析，从而为甜柿深加工提供理论依据，进而可以更好的开发和利用甜柿，促进甜柿产业化发展。3 研究内容甜柿成熟期，采取不同品种甜柿，通过提取并分离纯化，获得的甜柿多糖，利用高效液相色谱(HPLC)法测定甜柿多糖的分子量，采用苯酚一硫酸法测定甜柿多糖的含量；比较两种多糖制备方法的优劣，优化甜柿多糖制备方法；比较不同品种甜柿多糖分子量及多糖含量的差异，筛选出适宜做多糖深加工的甜柿品

8、种。4 预期目标1、比较两种多糖粗品制备的优劣，优化甜柿多糖制备的方法。2、通过试验获取不同品种甜柿成熟果实中多糖的含量、多糖的相对分子量、柿子多糖得率(%)等数据。3、对比测量的数据，筛选出适宜进行深加工提取活性多糖的甜柿品种。5 技术路线5.1 甜柿多糖粗品的制备新鲜甜柿洗净去蒂切片烘干粉碎过40目筛甜柿粉乙醚脱脂抽滤风干80%乙醇除杂(除去小分子糖、着类、生物碱等) 超声波处理热水浸提离心减压浓缩醇沉过滤无水乙醇丙酮乙醚多次洗涤干燥甜柿多糖5.2 季铰盐沉淀法上清液进行真空冷冻干燥获得白色絮状多糖流动自来水透析48 h (CTAB)上清液部分按四倍体积加入95%乙醇铰(CTAB)上清液部

9、分按四倍体积加入95%乙醇分离乳白色沉淀并用去离子水溶解后装入透析袋用10%的氯化钠水溶液将离心后的沉淀部分进行溶解铰(CTAB)分离浅棕色沉淀并用去离子水溶解后装入透析袋获得浅棕色多糖称取2g甜柿粗多糖溶解于50 mL的双蒸水中静置12 h后4000 rpm离心30min按体积比1: 1加入3%的十六烷基三甲基嗅化铰(CTAB)5.3 柿子多糖分子量的测定采用高效液相色谱(HPLC)法对柿子多糖的分子量进行测定。色谱柱采用SB804凝胶柱，流动相为高纯水，流速为0.8 mL/min，柱温为30，检测器为示差折光检测器。标准曲线的制作:以标准葡聚糖为标准品绘制标准曲线，葡聚糖浓度为2 mg/m

10、L，进样量20L以标准分子量的对数值为纵坐标，以色谱峰的保留时间为横坐标做标准曲线。样品的测定:色谱条件同标准曲线，样品浓度为2 mg/mL，进样量为20 L，利用标准曲线计算柿子多糖的相对分子量。5.4 柿子多糖的测定采用苯酚一硫酸法。5.4.1 标准曲线的制作葡萄糖标准溶液的配制:精确称取105烘箱中干燥至恒重的葡萄糖0.1 g于100 mL容量瓶，加去离子水至刻度，即得1mg/mL的葡萄糖溶液液。精确移取4mL上述葡萄糖液稀释至100mL，得40m留L的标准液，备用。苯酚试剂的配制:取苯酚100g，加铝片0.1g，碳酸氢钠0.05g进行蒸馏，收集182馏分，称取6g馏分，加去离子水94m

11、L溶解，配成质量分数为6%的苯酚溶液，备用。标准曲线的制作:精确移取葡萄糖标液0, 0.4， 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL，依次置于10个试管中，再分别补加去离子水至2 mL，加入5%的苯酚1 mL和浓硫酸5 mL静置10min，摇匀，再静置20min，以2.0 mL蒸馏水代替标准溶液同法操作为空白，490nm处测定吸光，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。5.4.2 柿子多糖含量的测定样品溶液的配制：准确称取柿子粗多糖粉2.0 mg，置50 mL容量瓶中，加去离子水溶解并定容至至刻度，备用。柿子多糖含量的测定：取

12、各样品溶液2mL按标准曲线制作方法操作，测定吸光值，由回归方程计算样品液浓度，按下式计算样品中多糖含量，校正因子取0.91。柿子多糖含量(%)=（C*N*100*0.91) /W式中，C为样品液浓度(mg/mL)；N为样品液的稀释倍数；W为样品重量(mg)。5.4.3 柿子多糖得率计算 柿子多糖得率(%)=柿子多糖质量/柿子粉质量*100%。外文文献概述文献名：Biologically Active Gibberellins and Abscisic Acid in Fruit of Two Late-maturing Japanese Pear Cultivars with Contrast

13、ing Fruit Size两种晚熟型日本梨中赤霉素与脱落酸对果实大小差异的影响摘要:“爱宕”和“新兴”是晚熟型日本梨，均是二十世纪和未知的品种杂交的后代，但它们显示不同的生长习性、果实大小、果实品质。为表现两品种之间在果实发育的差异，利用气相色谱/质谱法和水果的组织学方法在果实中发现了内源赤霉素（GA1、GA3、GA4）和脱落酸（ABA）。结果表明，细胞数量决定了两个品种间果实大小的差异。此外，果实发育期间特别是果实生长前期内源性生物活性赤霉素显示，“爱宕”比“新兴”具有更高水平的GA1，GA3和GA4。然而在果实发育初期，“新兴”比“爱宕”具有更高含量的ABA。与“新兴”相比“爱宕”在花期

14、后第一次生产高峰时，脱落酸浓度维持在极低的水平。赤霉素由一组具有生物活性四环二萜类化合物组成，并作为植物生长和发育的内源调节物质。此外，脱落酸对GA调节过程的拮抗作用是种子发育所必需的。一般来说，果实发育依赖于五大类植物激素和在这个过程中发挥主要作用，诱导果实的果皮、扩张，因此，他们在水果生产中具有重要实际应用。众所周知，日本梨果实生长具有细胞快速分裂的初始期，其次是一个长期的细胞膨胀过程。很多研究都集中在两个阶段，并得出细胞数量和细胞大小对果实最后的大小是非常重要的。因此，了解两个阶段的影响因素将有助于了解高等植物果实大小的调控机理。在日本梨中，有人认为GAs与果实发育密切相关。GA除了在维

15、持细胞增殖中的作用外，果实发育过程中GAs的应用也表明在果实发育的早期阶段，GAs可能在梨果实细胞分裂中发挥作用。在以前的报告中，证实了“爱宕”和“新兴”是具有黄褐色果皮的晚熟品，但他们表现出不同的生长习性、构造特点和果实生长速率。“爱宕”果实十一月上旬收获，生产上属于中度旺盛树枝型。最大的日本梨重达1500到2000克与中大型水果（400500 g），比“爱宕”早收获2-3周。这种品种的树木通常在种植后的最初几年是快速生长的，随后的特点是弱增长。以前的研究表明，两个品种之间的果实大小的差异是水果的库强度的结果，进一步的研究表明，GAs与日本梨的库需求的增强密切相关。因此，这项工作的主要目的是

16、确定在日本梨品种“爱宕”和“新兴”果实中内源性激素（GAs和ABA）水平，通过对照果实大小和果实的生长模式（细胞分裂/ 细胞增大）获取信息来评价GAs和ABA对果实生长的作用。结论新鲜水果的重量、细胞分裂、膨大，与种子的生长两个品种的果实季节性发育均遵循“乙”字型生长曲线。“爱宕”进入果实快速生长期早于“新兴”。另一方面，“新兴”果实膨大期较短，成熟期较长，生长曲线坡度比“爱宕”较缓。“爱宕”和“新兴”的细胞分裂时期分别为46天和61天。花后0天（开花），“爱宕”果实细胞比“新兴”少；然而，1周后，“新兴”的中果皮有更多的细胞。特别是，“爱宕”大幅增加的中果皮细胞数比“新兴”最后的果皮细胞数多

17、。然而，“新兴”比“爱宕”的大细胞（图多。此外，虽然“新兴”比“爱宕”果形小，两品种之间果核大小差别不明显。两个品种的特点是胚乳生长和细胞分裂停止后保持稳定，开花后种子长度、种子宽度、种子厚度迅速增加。进入果实膨大期前，种子重量增加缓慢，膨大期这两个品种重量大幅增加，其原因主要是快速的胚胎发育。内源性激素赤霉素和脱落酸的变化一般来说，两品种的内源GA1、GA3和GA4水平具有类似的变化曲线。“爱宕”果实中的GA1、GA 3和GA4含量在花后第4天最高，此后迅速下降。然而，开花后重要的GA1、GA 3和GA4水平显著降低。检测“新兴”果实赤霉素的第一高峰出现在花后第7-12天。两品种GA3最高的

18、水平超过GA1、GA4含量。随后，第一峰后测定的第二峰，GA3峰值比GA1晚，两品种GA4峰值出现在细胞分裂停止的时候。“爱宕”GA3和GA4的第二峰晚于“新兴”出现，他们在“爱宕”的GA水平也高于“新兴”。然而，“爱宕”GA1第二高峰出现早于“新兴”，GA1在两品种间的水平无差异。在果实快速发展过程中，品种之间的GA1的水平没有显著差异。GA3第三高峰出现早于GA4、“新兴”果实中GA3和GA4比“爱宕”第三峰出现时间早。赤霉素总量遵循类似单活性GA的曲线，一般“爱宕”GA比“新兴”具有较高的水平。ABA在花期后水平达到高峰，此后两品种维持在较高水平。然而，相比于“新兴”，“爱宕”花期后AB

19、A的浓度维持在低水平。细胞分裂期间，“新兴”ABA的浓度仍高于“爱宕”。虽然细胞膨大开始时ABA水平有所下降， “新兴”与“爱宕”果实中仍保持较高水平。讨论在植物体中，赤霉素的生物合成途径是相当复杂。他们被分为生产GA4的早期非羟基化作用通路，和早期生产GA1、GA3 的13-羟基化通路。在梨种子虽然有生物活性的GA类物质，通过GC 气相色谱-MS 质谱法只有GA3已经被分辨出。在这项研究中，GA1、GA3和GA4被成功识别，这表明在日本梨果实发育过程中早期的非羟基化和早期13-羟基化途径可能具有功能。赤霉酸和结果，细胞分裂的关系众所周知，种子植物成功坐果和随后的生长都依赖于传粉和受精，因为受

20、精激活了细胞分裂并产生激素触发果实生长，激素主要是赤霉素和生长素。GA1、GA3浓度在快速生长阶段增长率最高，但目前在未授粉子房和单性结实果的情况下生长的果实中浓度微量或不可检测。同样，梨果实生物活性GA水平在开花后达到高峰，花后迅速下降。比较两个品种中GA1，GA3和GA4在数量上的不同，结果表明，在日本梨果实中GA1、GA3或者只是其中之一参与了果实发育的调控。尽管已有研究表明日本梨中GA3诱导单性结实， GA3延迟胚囊退化，导致长时间的胚珠容受性、增加成功受精授粉。我们的未发表的数据也表明，在花期GA3是密切参与果实利用赤霉素结合的选择性抑制剂。众所周知，赤霉素在果实生长的主要作用是促进

21、细胞的扩展。另一方面，有一些迹象表明，赤霉素在细胞分裂中也发挥了作用。赤霉素外施用和两品种果实发育中早期抑制剂的效果表明，赤霉素可以显著地促进细胞分裂，并产生更大的果实。显然，赤霉素在梨果实细胞分裂过程中有着密切的关系。细胞分裂期间，“爱宕”中显著生物活性赤霉素的水平比“新兴”有意义，这一戏剧性的增加细胞分裂和细胞数前者比后者中果皮明显高，同时验证了赤霉素在这个过程中参与的事实。果实细胞分裂对品种之间的最终果实大小差异起到决定作用。种子萌发是赤霉素的重要来源。已有研究表明，花药发育产生的赤霉素是花冠形成的前提。此外，赤霉素也出现在花期后的花粉中，因为赤霉素被正常的花粉管生长所需要。有趣的是，据已有报告显示，赤霉素重新复活发生在花粉管萌发后。在人工授粉时，日本梨果实的生长是通过增加花粉数量实现的，在柱头上被激活，导致细胞分裂的增强并形成更大的果实。花期后，整体GA浓度急剧增加，有力地表明了赤霉素的形成可能与授粉和施肥过程密切相关。、在果实中、赤霉素往往集中在种子中，随着胚乳和胚胎发育，种子种类和数量产生改变。在这项研究中，赤霉素形成的第二和第三阶段分别对应胚胎和胚乳的形成。细胞分裂过程中种子的快速生长是胚和胚乳发育的结果，种子鲜重的急剧增加主要来源于胚的生长。此外，大量证据还表明，种源赤霉素是许多物种果实正常