第19章 生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用

1、第一章第一章 血液标本采集与处理血液标本采集与处理 临床免疫学检验技术 肖建华 第十九章第十九章 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统及其及其 在免疫在免疫检测技术中的应用检测技术中的应用 第一节 生物素的特性 第二节 亲合素和链霉亲合素的特性 第三节 生物素与亲合素结合反应的特点 第四节 BAS在免疫检测技术中的应用 1掌握生物素-亲和素系统的特点 2掌握BAS在免疫检测技术中的应用 3熟悉生物素-亲合素系统多级放大效应的原理 4生物素和亲合素（链霉亲合素）的理化性质 5. 了解活化生物素的制备方法 教教 学学 目目 标标 生物素-亲合素系统（biotin-avidin system，BAS

2、）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大 系统。 生物素与亲合素间高度亲合力，结合迅速、专一、 稳定。 既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质 ，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核 素等各种示踪物标记。 1个亲合素与4个生物素化分子结合及1个大分子物 质能与多个生物素结合特点，使BAS产生多级放大效应多级放大效应 ，极大地提高了免疫检测和分析的敏感性。 目前，BAS已广泛应用于整个生物学领域，是微量 抗原与抗体定性、定量检测及定位观察研究的常用技术 ，也是生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的 技术之一。 一、生物素理化性质 二、活化生物素 生物素（bioti

3、n，B）为含硫水溶性维生素，又称 维生素H或辅酶R； 动植物组织中广泛分布，卵黄（型）和肝（型 ）含量高，亦可人工合成。 分子式：C10H16O3N2S；MW：244.31 Da。 既能与抗原、抗体大分子生物活性物质结合，又能 与各种示踪物（如酶、荧光素等）结合。 羧基羧基 环为咪唑酮环，与亲合素亲合素结合部位； 环为噻吩环，C2上戊酸侧链戊酸侧链的未端羧基羧基是结合 生物大分子的唯一结构。 生物素侧链末 端羧基羧基经化学修饰 后制成带各种活性活性 基团基团的衍生物活 化生物素。 活化生物素 易与抗原、抗体 、酶及核酸分子 中相应基团偶联 形成生物素化生物素化 标记标记物物。 二、活化生物素

4、C NHNH CHCH2 CHCH O S(CH2)4COOH NH2 C O CH 2 CH2 CO NH OH C O ON C O O CCH2 CH2 EDC 生物素生物素 N-羟基羟基 丁二酰胺丁二酰胺 碳二亚胺碳二亚胺 生物素生物素N- 羟基丁二羟基丁二 酰亚胺酯酰亚胺酯 （BNHS） 1. 标记蛋白质氨基氨基的活化生物素 BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。 BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质。 生物素小分子与大分子抗体或酶结合后会产生 空间位阻效应空间位阻效应，对生物素与亲合素的结合以及 BAS的应用效果造成干扰。 长臂活化生物素（BCNHS）： 在生物素和N-

5、羟基丁二酰亚胺之间添加两个两个6-6- 氨基已糖分子基团氨基已糖分子基团，形成连结臂，增加B与大分子间 的距离，减少位阻效应，更好发挥生物素的活性作 用。 标记蛋白质氨基与醛基的活化生物素 2个个6-氨基已糖氨基已糖分子分子 2. 标记蛋白质醛基醛基的活化生物素 生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物用于 标记偏酸性糖蛋白 。 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸氨基连接 后与无水肼反应而成BCHZ还可标记氨基。 3. 标记蛋白质巯基巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) ：能特异地与 蛋白质巯基结合的活化生物素。 4. 标记核酸核酸的活化生物素 (1)光敏生物素(

6、photobiotin)： 侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后变为芳 香基硝基苯，与腺嘌呤N-7位氨基结合，形成生物素化 的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。 (2)生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）：作为 TTP的结构类似物，可采用缺口移位法通过DNase 和DNA聚合酶的作用而掺入到双链DNA中。 (3) BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4位 氨基结合，形成生物素标记的核酸探针，但对碱基 配对有影响。（不常用） 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价； 可标记生物活性大分子，如抗原、抗体。BNHS 多标记抗体，BHZ则多标记偏酸性抗原

7、，标记后抗原标记后抗原 、抗体活性不变、抗体活性不变； 可对示踪物标记，碱性磷酸酶标记后活性将降活性将降 低低。 一、亲合素 二、链霉亲合素 亲合素(avidin, A / AV) 和链霉亲合素 (streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。（ 实际应用中多用链霉亲合素） 二者均为大分子蛋白，目前所有用于标记的物质均 可与亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。 能与生物活性分子抗原、抗体结合，也能与示踪 物结合。多与酶、荧光素及胶体金偶联。 亲合素亲合素(AV)链霉亲合素链霉亲合素(SA) SA的pI低，表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异 性结合远低于AV，目前以SA标记

8、的酶结合物更为常用。 AV/SA耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结 合后稳定性更好，每个亲和素能结合四个分子的生物素。 BAS-WB WB 四、适用性广四、适用性广 一、特异性强一、特异性强 二、敏感性高二、敏感性高 三、稳定性好三、稳定性好 五、其他五、其他 两者间亲和力、专一性极高，试剂能 高倍稀释，非特异性反应低。 AV/SA能4价桥联生物素；一个Ab和酶 分子可连接多个B，多级放大效应。 两者结合呈不可逆反应；不受酸碱、 变性剂、蛋白酶等影响，稳定性极好。 可与多种标记技术结合，广泛应用于 临床和科研检测各种生物学反应体系。 可制成通用性制剂；效价高用量少， 成本低；有效期长；

9、反应时间短等。 一、固相载体的包被 二、检测系统的信号放大 生物素与亲合素之间的结合亲合力高、特异性 强； 两者各自均可与各型大小分子结合，且二者的 结合反应具有多级放大作用； 已广泛应用于各种标记免疫分析技术，BAS在免 疫标记技术中既可用于检测系统的信号放大，又可 用于固相载体的包被。 一、固相载体包被 固相吸附分离是非均相免疫分析重要的分离方法。 引入生物素-亲合素（链霉亲合素）系统连接于固相载 体表面，再与欲包被的抗原或抗体结合，实现间接包被， 可极大地提高非均相免疫分析的敏感性。包被方法有： （一）生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(Ag)包被 法 （二）链霉亲合素-生物素化抗体（或A

10、g）包被法 1.生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(或Ag)包被法 纳米纳米 微球微球 生物素化牛血清生物素化牛血清 白蛋白白蛋白(BSA) 亲合素亲合素 生物素化抗体生物素化抗体 生物素化生物素化-BSA 致敏微球致敏微球 2.链霉亲合素-生物素化抗体（或抗原）包被法 加生物素化抗体加生物素化抗体 纳米纳米 微球微球 亲合素亲合素 生物素生物素 链霉亲合素-生物素化抗体包被法(BA包被法)比生 物素-链霉亲合素-生物素化抗体包被法(B-BAB包被法) 简便、高效、省时省材； BAS连接固相载体的包被模式，可增加抗体(或Ag) 包被数量，减少空间位阻效应，提高检测的灵敏度和 准确度； 链霉亲合素

11、预包被磁性纳米微球可作为通用试剂，用 于反应体系成分的分离、纯化及不同项目的检测，如 发光免疫分析。 二、检测系统的信号放大 生物素-亲合素系统用于检测系统的信号放大， 基本模式有两种： （一）生物素-亲合素-生物素模式：BAB和ABC法 （二）生物素-亲合素( biotin-avidin, BA ) 或标记亲合素-生物素( labeled avidin-biotin, LAB ) 模式。 将生物素标记在第一抗体上称为直接法，将生物 素标记在第二抗体上称为间接法。 方方 法法 反应体系反应体系 直接法直接法 BABAg-(Ab-B)-A-B-E ABCAg-(Ab-B)-ABC (A-B-E)

12、 BA/LABAg-(Ab-B)-A-E 间接法间接法 BABAg-Ab1-(Ab2-B)- A-B-E ABCAg-Ab1-(Ab2-B)- ABC BA/LAB Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-E （一）生物素-亲合素-生物素模式 1. BAB法 以游离亲合素（或链霉亲合素）为桥，分别 连接生物素化抗体和生物素化酶，从而将抗原-抗 体待检系统和酶促反应的信号检测系统有机联系 在一起。 E E E E E E E E E Ag Ab Ag-Ab 生物素生物素 生物素化抗体生物素化抗体 双抗夹心双抗夹心游离游离AV/SA 生物素化酶生物素化酶 生物素化生物素化Ab-游离游离AV/SA-生物素

13、化酶生物素化酶 酶酶 生物素化酶生物素化酶 生物素生物素 化抗体化抗体 AV/SA 1. BAB法 直接法直接法 1. BAB法 直接法直接法 AV/SA ABC 2. ABC法 BAB改良法，将亲和 素(A或SA)先与生物素化 酶(B-E)结合，制成亲和 素-生物素-过氧化酶复 合物(avidin-biotin- peroxidase complex， ABC )。 E E E E E E B-Ab 双抗夹心法双抗夹心法直接法直接法 2. ABC法 直接法直接法 Ab SA SA SA ABC (SA-B-E) 生物素化抗体生物素化抗体 一个酶分子可结一个酶分子可结 合多个合多个B，B又可又

14、可 结合多个结合多个AV/SA。 （二）生物素-亲合素模式 BA法或LAB（标记亲和素-生物素）法 亲合素（或SA）直接标记酶或荧光素等示踪物， 生物素直接标记抗体（或抗原）。以标记亲和素代替 BAB法中的游离亲和素(A)，省却了加生物素化酶（B-E ）的步骤。 酶直接标记酶直接标记AV/SA B-Ab Ag E E E B-Ab E E E BAB法与BA法比较 BAB法：以游离亲和 素为桥，分别连接生物 素化抗体和生物素化酶 。 BA法 ：以酶标AV/ SA代替BAB法中的游离亲 和素，省却了加生物素 化酶的步骤。 EE E E E E 生物素化酶生物素化酶 游离游离AV/SA 生物素化生

15、物素化Ab E E E E E E 酶标酶标-AV/SA 生物素化生物素化Ab BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BAS在化学发光免疫分析中的应用 BAS在胶体金免疫技术中的应用 BSA在分子生物学中的应用 BAS在其它方面的应用：分子和细胞的分离与纯 化、肿瘤诊断与治疗、增强杂交细胞融合率等 生物素为B族水溶性维生素，环咪唑酮环是与AV/SA结 合部位，环噻吩环戊酸侧链末端羧基可结合生 物大分子 。经化学修饰后带活性基团成为活化生物素。 AV或SA是生物素天然特异性结合物，均为大分子蛋白， 由四个相同亚基构成，可结合4个生物素分子。 生物

16、素与AV/SA结合具有亲合力高、特异性强、敏感性 高、稳定性好等特点，使BAS适应性广、实用性强。 生物素和AV/SA均可与各种标记分子结合如Ab、酶。 1个AV/SA 可与4个生物素化物结合及一个生物大分子可 与多个生物素分子结合，使BAS具有多级放大效应，可极大 地提高分析测定的灵敏度。 BAS应用于检测系统的信号放大有两种基本模式：一种 是生物素-亲合素-生物素模式 ( 包括BAB和ABC法）；另一 种是生物素-亲合素(又称BA或LAB法）。 BAB法是以游离AV（或SA）为桥，分别连接生物素化抗 体和生物素化酶。将Ag-Ab反应与示踪系统连在一起。 ABC法是BAB改良法。预先制成可溶性的AV(或SA)-生物 素-过氧化酶复合物(ABC)，再与生物素化抗体结合。 BA或LAB法是将示踪物如