彗星电泳检测辐射诱DNA损伤南华大学预防医学与放射卫生实验b...b课件

1、彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 1 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤 黄波 南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 2 目的 掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 3 原理 单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis， SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经 Singh N P和

2、Olive P I进一步完善的一种在单细胞水 平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状 颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种 测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传 统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需 放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广 泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的 DNA损伤和修复的研究 。 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 4 步骤 射线照射细胞后，分别于照射后0h，30， 1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以 适量PBS重悬细胞； 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南

3、华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 5 胶片制备 取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(4570)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载）， 盖上盖玻片，4，15min.( 第二层越薄越好，使细胞 尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖， 4，15min。（第三层） 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.

4、b 6 细胞裂解与电泳 将制好的胶板揭去盖玻片后，侵入4预冷的新配制 的细胞裂解液中，4，2hr（溶解细胞膜及核膜， 除去蛋白质、RNA等，仅存核骨架） 将载玻片置于0.5%TBE中，1hr更换一次，共2hr 将载玻片置于电泳槽中，加入0.5%TBE没过盖玻片， 25V、8mA、4、25min. 取出载玻片，用吸水纸吸干 每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 7 取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸 水纸吸干； 每片载玻片上加60l 2g/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）； 用casp. exe软件分析细胞拖尾变化 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 8 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 9 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 10 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放射卫生实验 b.b 11 彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤南 华大学预防医学与放