试述基因工程研究的原理与基本路线并举例说明其在转基因动物方面的应用

1、试述基因工程研究的原理与基本路线并举例说明其在转基因动物方面的应用基因工程是按照人们的愿望对携带遗传信息的分子（DNA）进行设计和改造,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术;包括基因重组、克隆、表达；其核心是构建重组体DNA的技术，因而基因工程和DNA重组技术有时成为同义词。当代人类社会所面临的人口的增加、食品的短缺、疑难病的治疗、资源的匮乏、环境染的加剧等重大问题,都在不同程度上依赖于生物技术的研究加以解决。因为生物技术能利用生物资源的可再生性,在常温常压下生产珍贵药品;节约能源和资源、减少环境污染;能创造动植物优良新品种,增加粮食生产,开辟食物新来源

2、;解决疑难病的治疗,并能对相关的传统行业技术改造和产业结构调整产生极其深远的作用。所以生物技术蕴藏着巨大的经济潜力和社会效益。生物技术的发展,仅有20多年的历史。然而在世界范围内给医学带来了一场革命性的变化,给农业带来了新的绿色革命,使轻工、食品、环保、海洋、能源开发等有关领域得到了前所未有的发展。一、基因工程的原理现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，也就是基因克隆技术。既然基因工程这么重要,那么什么是基因工程呢? 基因工程（

3、genetic engineering），是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是指利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程1。根据这个概念，人们可以从一个生物的基因中提取有用的基因片断，植入到另外一个生物体内，从而使该生物获得某些新的遗传性状。从而获得所需要的新的生物的变种，运用基因工程可以加快生物的变异，并使生物的变异朝着有益于人类的方向发展。同时，这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生

4、物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞DNA的技术称为“基因系治疗”（germlinetherapy），通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。而且基因工程是处在分子水平上的操作，因而可以跨越不同的物种进行操

5、作，大大改善了传统的只能同类生物杂交并且不能控制变异方向的方法。不同种的生物一般是不能交配的，例如鱼和牛，就不能进行交配而生出下一代。但是利用基因工程，我们可以把鱼的某些基因移植到牛的受精卵上，或者把牛的基因移植到鱼的受精卵上，加以培养，就可以产生既有牛的性状又有鱼的性状的新的物种。虽然基因工程有这么多的好处，但是也不是说可以滥用的。因为每种生物经过适者生存的自然选择，都能适应所处的生存环境.如果移植了外来的基因，可能会打破其体内的细胞的平衡，从而导致细胞的快速衰老甚至死亡。可见，基因工程要正确处理好细胞的相容性。二、基因工程的基本路线：一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为

6、方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。基因工程的基本操作程序2（如图1）：从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。在体外，将带有目的的基因的外源DNA片断连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，现成重组DNA分子。将重组DNA分子转

7、移到适当的受体细胞，并与之一起增殖。从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的受体细胞克隆。从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究实用。将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能的表达，产生出人类所需要的物质。 图1 基因工程的一般步骤（一）、目的基因的获取1直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用2人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其

8、互补DNA（cDNA）4从基因文库中筛选5利用PCR合成（二）、目的基因与载体DNA体外重组1. 粘性末端连接法（如图2）：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法2.人工接尾法（如图3）3.人工接头连接法（如图4） 图2 粘性末端连接法 图3 人工结尾法 图4 人工接头连接法（三）、重组DNA分子导入受体细胞重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞。如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfe

9、ction)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。（四）筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）1.根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法（如图5）进行筛选。 图5 插入灭活法2. 根据标志互补进行筛选转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his- 在不含组氨酸的 外源基因：his+ 培养基中生长3.根据DNA限制酶谱进行分析（如图6） 图64.用核酸杂交法（如图7）进行分析鉴定采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 图7 核

10、酸杂交法（五）、外源基因的表达1 、原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系 ，尚有一些不足之处：缺乏转录后加工机制，只能表达克隆cDNA，不宜表达真核基因组DNA，缺乏适当的翻译后加工机制，表达真核蛋白质不能形成适当折叠或进行糖基化修饰；很难表达大量的可溶性蛋白等。2、真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。三、基因工程在转基因动物上的应用：（一）转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受

11、体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）3。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。（二）转基因动物技术 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显

12、微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。 1受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。显微注射法(microinjection)是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术4。1974年，Jaenisch5应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40 DNA转基因小鼠。1981年，Costantini6将兔一珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵发育成小鼠，表达出了兔一珠蛋白。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，

13、以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。本方法是在显微镜下，用直径约为1m的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50 kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于

14、受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。2胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织7。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中

15、，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。3.反转录病毒转移基因反转录病毒感染法(retrovirus-mediated gene transfer)主要是利用反转录病毒DNA的长末端重复序列(LTR)区域具

16、有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上8。反转录病毒是一类含有RNA的动物病毒，它的基因组进入寄主细胞内，在反转录酶催化下合成DNA。反转录病毒的这种特性说明它有可能是一种天然的转导因子，可经人工操作改建为动物基因的转移载体。另外，反转录病毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡，被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。反转录病毒可用作载体的另一个优点是其寄主范围广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长。 （三）转基因动物的应用 转基因动

17、物的研究内容非常广泛，20世纪8090年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。1在基因表达调控研究方面的应用 利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。（1）顺式调控元件的研究 异常的脂蛋白水平与动脉粥样硬化等疾病有关。人类有5种脂蛋白，各自含有不同的载脂蛋白。现已发现约有17种载脂蛋白，它们的编码基因已测序，是用于研究心血管疾病的候选基因。把载脂蛋白基因转入小鼠，可用来研究人脂蛋白代谢、调控以及动脉粥样硬化。在研究载脂蛋白基因组织特异性表达的顺式调控元件时，发现有

18、两簇载脂蛋白基因凋节的组织特异性表达。一簇包括A、C-和 A-基因，定位于人11号染色体长臂2区3带（11q23），是按A、C、A的顺序组成。C的转录方向与其他两个基因相反。 A-和C-主要在肝和小肠中表达，A-主要在小肠表达。在 C-基因的-0.2-1.4bp之间是调节 A基因在小肠中表达的区域。这个区域也是 C和A基因在小肠表达的凋控元件，表明这一元件可以调节整个载脂蛋白基因簇在小肠的表达。另一基因簇定位于19号染色体长臂1区3带（19q13），包含有E、C和C-基因，它们按E、C、C顺序排列。E基因主要在肝脏和大部分身体组织中表达，但表达水平低。以后发现在C基因和C基因之间有一调控区可使

19、E基因在肝脏内高水平表达，该区长约154 bp。此外，还证实这个调控区也调节该座位其他两个载脂蛋白基因 C和 C在肝脏的表达。（2）与发育相关基因的表达与调控 用转基因动物可研究基因在发育中的时空调控。珠蛋白基因是研究发育调控的最好例子。人类珠蛋白基因分为、两簇，分别定位于16号和11号染色体，各长30kb和60kb。据1993年的报道，为分析完整的-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的开关调控，Peterson等把一个含有248 kb长的人-珠蛋白基因簇的酵母人工染色体（YAC）转入小鼠。对转基因小鼠中此基因簇的表达分析表明，在成年的转基因动物中只有人-珠蛋白表达；在子一代和子二代动物中证实YAC

20、座位有样珠蛋白基因的发育开关调控，即在卵黄囊中有-和-珠蛋白基因表达，在14天的肝脏中有少量和大量表达，而在成年动物中则仅有珠蛋白基因的mRNA表达。采用先在酵母细胞内通过同源重组的方式使YAC发生突变，然后把这种突变的YAC导入小鼠，就可以详细研究整个座位上基因的调控机制，如珠蛋白基因在发育与分化中的基因表达、定点诱变的基因对发育凋节的影响等等。 除前述有关基因表达凋控的研究外，把转基因动物用于遗传病动物模型的研制近年来发展也很快，如把pro-胶原突变基因导入小鼠基因组，可产生类似人的骨发育不全症的转基因小鼠，这对了解人类遗传病的发病机理意义重大。2用于基因产品的制备在转基因动物中，导入的目

21、的基因表达，人们就可以从该动物的乳汁和血液里获得目的基因产物，因此，可把转基因动物看作是一种个体表达系统（whole animal expression system），以制备某种基因产物。这样的转基因动物常被称作动物生物反应器（animal bioreactor）。1982年Palmiter把大鼠生长激素基因转入小鼠，成功地获得高效表达生长激素的小鼠，其体积明显增加，证实了用转基因动物生产外源基因产品的可行性。近年来的报道已证实在转基因家畜（如猪）的乳腺中可高效合成自身不含有的异源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英国正在研究通过羊-乳球蛋白启动子和乳清蛋白启动子的控制，在转基因羊体内表达人1抗胰蛋

22、白酶和凝血因子；在美国已有在转基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分别表达产生tPA和促性腺素的研究报道。我国利用转基因动物为反应器生产基因制品的工作也在展开，最近有关单位已从转基因羊乳汁中获得促红细胞生成素。3动物品种的培育与改良通过外源基因的导人，改造动物的基因组，可达到使家畜、家禽的生长速度加快，肉、蛋或奶产量及品质提高，饲料利用率提高、抗病力加强的目的。加上体细胞克隆技术能使优良种畜迅速扩群，可在短时间培育出新品种。对于动物遗传资源保护的意义更加深远，对濒危物种挽救是必不可少的。目前这方面的应用也是转基因动物最具经济开发前景的领域之一。把具有优良性状的基因或抗病基因导入畜禽以培育新的品种，这是转

23、基因动物研究中的一个极重要的方面。如已培育出抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种。丘才良9把一种寒带比目鱼抗冻蛋白基因(AFP)成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试，魏彦章10利用人生长激素基因构建的转基因鲤鱼，表现出快速增长的效应。1985年我国学者朱作岩在国际上首次将小鼠MThGH融合基因注入金鱼受精卵中，获得转基因金鱼，其F1比转基因鱼的同代大两倍。以后该类实验中还陆续获得其他鲫、鲤等几种转入生长激素基因的鱼。四、展望基因工程技术以其巨大的生命力影响着人类的生活 ，并已逐步渗透到人类生活的各个领域。随着转基因技术领域的不断拓展，在实验室获得的新突破和技术成果不断地运用到生产实践中去，创造出更多具有优良经济性状的不同种类的转基因动物，使地球的生物圈变得更加丰富多彩。转基因技术的出现与发展为研究动物改良、抗病育种方面，探明人类疾病发病机理研究以及建立人类遗传疾病的转基因动物模型，建立动物生物反应器来生产天然活性药物蛋白和基因治疗以及生产人类器官代用品等方面极具有开发潜力，转基因技术的成熟和推广将给人类带来无限光明 。参考文献：1李立家，肖庚富基因工程 M 北京：科学出版社，2 0 0 4 ：1 2苏明学“基因工程的基本操作程序”的教学分析与设计J生物学通报，2009（44）：33基因工程与转基因动物J中国禽业导刊。2001（1