微生物学检验病毒检验技术

1、微生物学检验微生物学检验 第十七章 病毒检验技术 返回总目录返回总目录 本 章 内 容 第一节 标本的采集、处理与运送 1 第二节 病毒的分离与鉴定2 第三节 病毒学检测及诊断3 学习目标及重点 学习目标： 掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用 技术 熟悉病毒血清学诊断常用的方法 了解病毒感染的实验室快速诊断 学会病毒的培养基本操作 本章重点： 病毒标本采集和运送原则。 病毒学诊断及鉴定常用方法。 病毒培养的基本操作。 第一节 标本的采集、处理与运送 一、标本的采集与处理 1. 采集时间：发病早期或急性期尽快采集。 2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。 如：流感病毒

2、感染-鼻咽拭子 乙型脑炎病毒感染-脑脊液 轮状病毒感染-粪便 乙型肝炎病毒感染-血液 3.采集方法与处理 提高病毒的分离率，防止标本污染。 采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌 二、二、标本的运送与保存 1.1.标本的运送 尽快送检 冷冻、冷藏运输 防漏、专人、标记 2.2.标本的保存 -70可较长时间保存 可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防 病毒失活 第一节 标本的采集、处理与运送 返回章内容返回章内容 一、 病毒的分离培养 2.鸡胚培养 第二节 病毒的分离与鉴定 原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞 羊膜腔接种 尿囊腔接种 卵黄囊接种 绒毛尿囊膜接种 组织

3、细胞培养 鸡胚培养 动物接种 1.组织细胞培养 鸡成纤维细胞 Hep-2细胞 细胞培养瓶 Vero细胞 第二节 病毒的分离与鉴定 9 一般选用914d的鸡胚 来源充足、 组织分化程度低、 本身很少携带病毒和细菌、 对接种病毒不产生抗体及 病毒较易增殖等 2.鸡胚培养 优点： 第二节 病毒的分离与鉴定 选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键 常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种 2.鸡胚培养 第二节 病毒的分离与鉴定 2.鸡胚培养 尿囊腔接种 羊膜腔接种 尿 囊 腔 羊 膜 腔 常用接种途径： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种 常用于流感病毒、流行

4、性腮腺炎病毒 和新城疫病毒的适应和传代培养 常用于临床流感病毒初次分离 第二节 病毒的分离与鉴定 卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种 卵 黄 囊 绒毛尿囊膜 人工气室 羊膜腔 气室 绒毛尿囊膜 尿囊腔 卵白 2.2.鸡胚培养 主要用于虫媒病毒、衣原体及立 克次体的分离和繁殖。 常用于牛痘病毒、天花病 毒、单纯疱疹病毒的分离 卵卵 黄黄 囊囊 第二节 病毒的分离与鉴定 3.动物接种 常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等 常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及 脑内接种等方式 第二节 病毒的分离与鉴定 二、病毒增殖的观察 （一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 2红

5、细胞吸附 3细胞培养液pH值改变 （二）病毒数量及病毒感染性测定 1血凝试验 2中和试验 3空斑形成试验 4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50） 第二节 病毒的分离与鉴定 二、病毒增殖的观察 （一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE） 第二节 病毒的分离与鉴定 正常细胞 病变细胞 是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生 长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落， 细胞堆积形成葡萄状 第二节 病毒的分离与鉴定 （2）多核巨细胞 1细胞形态的改变 多见于有包膜的病毒， 如呼吸

6、道合胞病毒、麻 疹病毒等，由感染细胞 融合而成多核巨细胞 第二节 病毒的分离与鉴定 （3）包涵体 1细胞形态的改变 某些病毒感染宿主细胞后， 细胞内出现一种光学显微镜下 可见的蛋白质结构，多为圆形、 卵圆形或不定形。一般是由完 整的病毒颗粒或尚未装配的病 毒亚基聚集而成，称为包涵体。 第二节 病毒的分离与鉴定 2红细胞吸附 3细胞培养液pH值改变 二、病毒增殖的观察 病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培 养液pH值改变。 第二节 病毒的分离与鉴定 （二）病毒数量及病毒感染性测定 二、病毒增殖的观察 1血凝试验 病毒颗粒红细胞 某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺

7、 乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细胞后收集的病毒液作不 同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效 价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。 血凝现象 第二节 病毒的分离与鉴定 能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血 凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU） 第二节 病毒的分离与鉴定 病毒颗粒 红细胞病毒抗体 血凝抑制试验 病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗 原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑 制试验。 第二节 病毒的分离与鉴定 2中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗 体相互反应，再将混合

8、物接种到敏感的宿主体内，经培养 后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否 中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法 3空斑形成试验 第二节 病毒的分离与鉴定 4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50） 测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病 变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测 定感染性病毒颗粒的多少 返回章内容返回章内容 第二节 病毒的分离与鉴定 第三节 病毒学检测及诊断 一、形态学检查及诊断 1. 光学显微镜检查： *直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） *包涵体 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵体 巨细胞病毒感染-“猫头鹰眼”状的

9、嗜酸性包 涵体 2. 电子显微镜检查： *透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等 *扫描电子显微镜： 用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 一、形态学检查及诊断 扫描电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断 H1N1流感病毒电子显微镜图片狂犬病病毒电子显微镜图片 第三节 病毒学检测及诊断 （1）标本制备 超滤法 超速离心法 接种细胞快速增殖法 免疫凝集法 （2）常用观察方法 负染色法 超薄切片法 免疫电镜法 病毒颗粒具有亮度，在周围 较暗的背景上显示亮点 过程与病理切片过程相似 免疫组织化学与电镜技术的结合 透射电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断 二、血清学检测及诊断 原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原 1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒 抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg 第三节 病毒学检测及诊断 2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技 术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。 检测抗体的类型确定患者所处感染阶段 -急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染 -IgG含量的测定应取病人急性