短柄五加叶片皂苷对果蝇繁殖力的影响研究

1、陇东学院生命科学与技术学院2013届本科生毕业论文编号 2009041213 毕 业 论 文（设 计）（ 2013 届本科）论文题目：短柄五加叶片皂苷对果蝇繁殖力的影响研究学 院： 生命科学与技术学院 专 业： 生物教育 班 级： 09级生科2班 作者姓名： 王 富 宏 指导教师： 李东波 职称： 讲师 完成日期： 2013 年 5 月 1 日目 录诚 信 声 明20 引言41实验部分41.1实验材料、仪器及药品41.2 药品及培养基的配制51.2.1 皂苷溶液的配制51.2.2 培养基的配制51.3实验方法51.3.1 亲本果蝇分组与培养51.3.2 F1果蝇数量统计51.3.3 F1果蝇分

2、组方法61.3.4 F2果蝇数量统计61.4 数据处理方法62 结果与分析62.1 皂苷对F1羽化果蝇数量的影响62.2 整个发育期皂苷对果蝇繁殖力的影响72.3 幼虫期皂苷对果蝇繁殖力的影响72.4 果蝇唾液腺的剥离及制片73 讨论与结论104 展望10陇东学院全日制普通本科生毕业论文 诚 信 声 明 本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结

3、果由本人承担。 作者签名：2013年5月1日第 0 页短柄五加叶片皂苷对果蝇繁殖力的影响研究李东波 王富宏 (陇东学院生命科学与技术学院 甘肃 庆阳 745000)摘要:本文研究了短柄五加叶片皂苷对果蝇繁殖力的影响，在对照组培养基中加入不同体积66mgmL-1短柄五加叶片皂苷溶液对果蝇进行培养，在35d内统计完成羽化的F1、F2果蝇数量。F1羽化果蝇数量与对照组相比，0.132 mgmL-1、0.264mgmL-1药物组第一次统计羽化果蝇数量有显著增加(P0.05)，增值率分别达到17.15%和35.75%，但随着对果蝇处理时间延长，子代果蝇数量减少越来越显著，增值率达到-85.80%。对F2

4、羽化果蝇数量统计表明，在果蝇整个发育期均添加皂苷和只在幼虫发育期添加皂苷，其结果大致相同，药物组F2羽化果蝇数量与对照组相比减少均达极显著水平(P0.01)。实验结果表明皂苷有抑制果蝇繁殖力的作用，本研究为开发新的农药提供了科学依据。关键词:短柄五加；果蝇；繁殖力；皂苷Acanthopanax brachypus leaves saponins on Drosophila melanogaster breeding impact studyLI Dong-bong,WANG Fu-hong(Longdong College of Life Science and Technology, Gan

5、su Qingyang 745000)Abstract:This paper studies Acanthopanax brachypus leaf saponin effect on Drosophila melanogaster fecundity,In the control group culture medium with different svolume Acanthopanax brachypus leaves saponins 66 mg mL - 1 leaf saponins solution was carried out Drosophila melanogaster

6、,Within the 35d statistics to complete the number of F1, F2 Drosophila melanogaster.Formula one feather fly number compared with the control group,0.132 mg mL-1, 0.264 mg mL-1 feather fly number for the first time statistics have drug group increased significantly(P0.05),Increment rate reached 17.15

7、% and 35.75%, respectively,But as for Drosophila melanogaster extend processing time,The decrease in the number of children fly more and more significant，Increment rate reached to 85.80%.Statistics show that on the number of F2 feather flies，Add saponins in Drosophila melanogaster the whole growth p

8、eriod and only add saponins in larval development period,The result is roughly same,F2 feather fly number compared with the control group to reduce drug group have reached very significant level (P 0.01).The experimental results showed that saponins have inhibitory effect of Drosophila melanogaster

9、breeding, this study provides scientific basis for the development of new pesticides.Keywords: Acanthopanax brachypus; Drosophila melanogaster; fecundity; saponins0 引言短柄五加(Acanthopanax brachypus)为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)多年生落叶小灌木，在世界范围内的分布范围极其狭窄，主要分布于我国西北黄土高原上的陕西、甘肃、宁夏等地，是我国特有的民间药用植物。短柄五加含有黄酮

10、和皂苷等活性成分。药用和食用价值很高，其药用部位主要为茎皮和根。据研究表明：其根茎的提取物除具有治疗神经衰弱、男子性功能障碍、继发性高血压、低血压、白细胞减少等疾病外，还有防癌抗癌功效；其皮的醇提物具有抗炎作用，还可抑制佐剂关节炎及、型变态反应性炎症2。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是生物学研究中最重要的模式生物之一，是一种体长约3mm的昆虫，因其常聚集在腐烂的水果周围而得名果蝇(fruit fly)。它作为模式生物的优势主要有体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短、繁殖力强、子代数量多，以及便于进行表型分析、有利于一般实验室使用等。基于清晰的遗传背景和便

11、捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域都占据了不可替代的位置。2000年，果蝇全基因组测序基本完成，只有4对染色体，全基因组约165 Mb (人类基因组约3300Mb，约有30000个基因)。编码蛋白的基因有13600种，约一半蛋白与哺乳动物蛋白有序列同源性3。超过60%的人类疾病基因在果蝇中有直系同源物。这就是本文选用黑腹果蝇作为研究对象的原因。1实验部分1.1实验材料、仪器及药品材料：以陇东学院生科院遗传实验室饲喂的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)野生品系为材料。短柄五加(Acanthopanax brachypus)叶片采自正宁县中湾林场（鉴

12、定人：郭小强）；叶片皂苷（陇东学院生物技术室已提取）。仪器：智能型光照培养箱（MGC-300A），电热恒温鼓风干燥箱(DNG-9070A，上海一恒科技有限公司），电子天平(BS223S，赛多利斯科学仪器有限公司），电炉，烧杯，量筒，玻璃棒，移液管，试管，试管架，洗耳球等。药品：玉米粉（散称，市售），琼脂（卡拉胶条状，海南省琼海市长坡琼脂厂），酵母浸粉(250g,北京奥博星生物技术有限公司)，白糖(散称，市售），乙醚（分析纯，500mL，天津市化学试剂二厂），丙酸（分析纯，500mL，西安化学试剂厂）。1.2 药品及培养基的配制1.2.1 皂苷溶液的配制根据药物培养基中皂苷的质量浓度(0.660

13、mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1)将皂苷配制成66mgmL-1的溶液100mL，只需称取6.6g的皂苷加入100mL的蒸馏水进行溶解，即得66mgmL-1的皂苷溶液。要配制含皂苷质量浓度为0.6600mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1药物培养基只需分别加入0.5mL、1mL和2mL皂苷溶液。1.2.2 培养基的配制 A液：准确称取5.6g玉米粉，4.4g白糖将其置于烧杯中，加入30mL蒸馏水用电炉加热并不断搅拌直至糊状。B液:称取0.5g琼脂放入烧杯中，加入20mL蒸馏水用电炉加热并不断搅拌直至琼脂完全溶解。将A液和B液混合均匀后，依次加入

14、0.5g酵母粉，0.4mL丙酸并搅拌均匀即可得对照组培养基。药物组培养基配制方法与对照组培养基配制方法相同，只需在加入丙酸后再加入所需的皂苷溶液。1.3实验方法1.3.1 亲本果蝇分组与培养收集8h内羽化亲本果蝇，分雌雄后，雌雄果蝇随机组合成20对，分别放入事先装有皂苷浓度为0mgmL-1、0.660mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1培养基的4组试管中，每组5个平行组，共20支，每支试管中雌雄果蝇各1只，置于培养箱中室温培养。1.3.2 F1果蝇数量统计每对亲本果蝇在试管中培养7d后，转移至含相同皂苷浓度培养基的试管(新管)中继续培养。移除亲本的试管(原管)也继续培养

15、。再过7d后，在移除亲本的试管(原管)中开始有新羽化的F1果蝇出现。每天统计新羽化果蝇数量，连续统计7d，作为第一次统计数据。转移至另一试管中(新管)继续培养的亲本，在新试管中培养7d后做同上处理，作为第二次统计数据，同上，统计第三次数据，求每次统计的增值率。增殖率=(处理组羽化果蝇数对照组羽化果蝇数)/对照组羽化果蝇数100%1.3.3 F1果蝇分组方法统计F2果蝇，实施了两个实验方案：一个是收集8h内羽化的4个处理的F1果蝇，分雌雄后，分别对应放入装有对照组培养基和药物组培养基的20支试管中培养。共4个处理，每个处理5个平行组，如表2。这样，处理组果蝇从幼虫期直至成虫期均用短柄五加叶片皂苷

16、处理。另一个是收集8h内羽化的4个处理的F1果蝇，分雌雄后，分别对应放入装有对照组培养基的20支试管中培养。共4个处理，每个处理5个平行组，如表3所示。这样，处理组果蝇仅幼虫期用短柄五加叶片皂苷处理。1.3.4 F2果蝇数量统计每对F1雌雄果蝇在试管中培养7d后，移除F1果蝇。移除F1果蝇的试管继续培养。再过7d后，在移除F1果蝇的试管中开始有新羽化的F2果蝇出现。每天统计新羽化果蝇数量，连续统计7d，作为F2果蝇统计数据。1.4 数据处理方法数据用SPSS16软件处理，应用完全随机设计的单因素方差分析中的LSD法进行分析比较。2 结果与分析2.1 皂苷对F1羽化果蝇数量的影响对F1羽化果蝇数

17、量进行统计，结果如表1所示。与对照组比较，0.132 mgmL-1、0.264mgmL-1药物组第一次统计数据有显著增加(P0.05)，增值率分别达到17.15%和35.75%，表明皂苷有增加果蝇繁殖力的作用。但第二、三次统计结果表明，随着对果蝇处理时间延长，子代果蝇数量减少越来越显著，第三次统计结果与对照组相比均达极显著水平(P0.01),说明皂苷对果蝇繁殖力有抑制作用，但并无剂量效应，组间无显著差异。表1 短柄五加叶片皂苷对果蝇F1羽化成虫数量的影响皂苷浓度/mgmL-1 第一次统计数据 增值率/% 第二次统计数据 增值率/% 第三次统计数据 增值率/% 0 23.33 0.882 22.

18、13 0.465 23.45 0.333 0.660 22.002.517a -5.70 10.670.2642a -51.78 4.330.333A -81.54 0.132 27.33 2.603ab 17.15 12.001.528a -45.77 4.000.577A -82.94 0.264 31.670.333b 35.75 8.670.882a -69.89 3.330.333A -85.802.2 在整个发育期皂苷对果蝇繁殖力的影响在果蝇整个发育过程中均添加短柄五加叶片皂苷，统计F2羽化果蝇数量结果如表2所示。与对照组相比，各处理组的F2羽化果蝇数量的减少均达极显著水平(P0.

19、01)，表明皂苷严重减弱了果蝇的繁殖力。表2 整个发育期短柄五加叶片皂苷对果蝇F2羽化成虫数量的影响皂苷浓度(幼虫期)/mgmL-1 皂苷浓度( 成虫期)/mgmL-1 统计数据 增殖率/% 0 0 23.330.882 0.660 0.660 0.67 0 .333A -97.13 0.132 0.132 0.67 0 .333A -97.13 0.264 0.264 0. 33 0 .333A -98.59 2.3 在幼虫期皂苷对果蝇繁殖力的影响仅在果蝇幼虫发育过程中添加短柄五加叶片皂苷，统计F2羽化果蝇数量结果如表3所示。0.132mgmL-1和0.264mgmL-1药物组中没有F2果蝇

20、产生，虽然0.660mgmL-1药物组中有F2果蝇产生，但其增值率却为 -98.56 %，与对照组相比，各处理组的F2羽化果蝇数量的减少均达极显著水平(P0.01)，表明皂苷严重减弱了果蝇的繁殖力。表3 幼虫期短柄五加叶片皂苷对果蝇F2羽化成虫数量的影响皂苷浓度(幼虫期)/mgmL-1 皂苷浓度( 成虫期)/mgmL-1 统计数据 增殖率/% 0 0 23.330.882 0.660 0 2.671.202A -98.56 0.132 0 0 -100 0.264 0 0 -100 2.4 果蝇唾液腺剥离及制片为了研究皂苷对果蝇繁殖力的影响，在本实验之前做了一些前期预备工作，对果蝇三龄幼虫进行

21、唾液腺剥离及制片，在基因水平研究皂苷的药理效应。将正常果蝇染色体与药物处理果蝇染色体进行对比，观察是否出现染色体断裂、缺失、异位等基因突变现象，再进一步定位到具体的基因上，从而得出药物引起果蝇繁殖力减弱的直接原因。前期实验的成果如下图所示：图1 果蝇唾液腺图2-1 果蝇唾液腺染色体图2-2 果蝇唾液腺染色体图2-3 果蝇唾液腺染色体3 讨论与结论在野外调查发现短柄五加叶片不易受虫侵害。研究显示，由F1统计结果表明短柄五加叶片皂苷对果蝇的繁殖力有严重的影响作用，在皂苷处理初期一定程度上可以增加F1果蝇数量，表明皂苷有增进果蝇精子和（或）卵子产生的作用，或对果蝇受精有促进作用。但随处理时间延长，其

22、F1果蝇数量急剧减少，表明皂苷对果蝇生殖腺有损害作用，造成果蝇不育或不孕。由表1第一次统计数据可以表明，皂苷并不具有杀精、杀卵或抑制排精、排卵的作用。由F2统计结果表明，在果蝇全发育时期和幼虫时期用皂苷处理其结果大致相同，说明皂苷对果蝇幼虫生殖腺损害作用更为严重。这种损害作用是由亲本基因突变引起还是由幼虫自身抗药性能力弱引起，还需进一步研究。本文研究得出的结论为：短柄五加叶片皂苷对果蝇的生殖腺有严重的损害作用，导致果蝇子代数量严重下降，这用来开发农药具有广阔的前景。4 展望由于时间限制和能力不足，本论文有许多不完善之处，致使论文还有许多工作要做。如果按下列实验方案，将亲本果蝇雌雄分开分别用对照、0.132mgmL-1药物培养基培养7d、14d、21d，每7d更换一次培养基。然后按下列实验方案组合，用对照组培养基培养7d，每个处理5个平行组，统