(完整word版)实验报告-硝酸还原酶活性的测定(word文档良心出品).doc

1、(1)0.1M(2)0.1M首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称 植物生理实验实验时间2010.3.31成绩姓名 唐倪文班级 3学号 1090800032实验题目 硝酸还原酶活性的测定一、实验原理-硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于 NO3 使之还原为 NO2- 。-+-+NO3+NADH +H NO2+ NAD + H2O-可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反产生的 NO2应液中 NO2- 含量的增加即表明酶活性的大小。-含量的测定 -磺胺法NO2NO 2- 与磺胺和- 萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物， 用比色法在 520nm下读取光密度值。二

2、、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具： 722 型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪， tip 头（两种规格： 1000 l ， 200l ）三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中磷酸缓冲液 5ml + 蒸馏水 5ml磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNO3 5ml2. NO2- 的获得(1) 称取新鲜叶片 0.5g 共四份 , 剪成小片 , 分别置于小烧杯内的反应液中。(2) 在真空干燥器中抽气 20min, 使叶片沉于溶液底部 , 溶液即可渗入组织内取代其-中的空气 , 内部产生的 NO2 可渗透到外部溶液中。3. 将小烧杯转到

3、30温箱 , 使其不见光 , 保温 20min。4.用 5 g/ml NaNO 母液配制标准梯度溶液5、4 、3、 2、 1、 0.5、0.1 、20g/ml 。5. 吸取不同浓度的 NaNO21ml 于试管中，加入磺胺试剂 2ml 及 - 萘胺试剂 2ml，混合均匀，在 60水浴中保温 20min，于比色杯中，在 520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度浓度曲线，以光密度为纵坐标， NaNO2浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。试剂管号NaNO母液 (ml)1234567800.020.10.20.40.60.81.02蒸馏水 (ml)10.980.90.80.60.40.

4、201磺胺 (ml)222222220.2 - 萘胺22222222(ml)每管亚硝酸氮含00.10.51.02.03.04.05.0量（ g）每管 NaNO2浓度00.10.51.02.03.04.05.0（ g/ml ）光密度00.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493标准曲线：5. 吸取反应液各 1 ml 于试管中加入磺胺和- 萘胺各 2 ml,60 水浴 20min, 生成-的含量，粉红色化合物 . 用比色法在 520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得 NO2结果如下表。小麦幼苗KNO完全培养液KNO缺 N培养液HOH O3232小麦鲜重 (g)0.510

5、.510.490.48光密度0.1780.1760.0650.039亚硝酸钠浓度1.7911.7710.6540.392（ g/ml ）亚硝态氮含量1.7911.7710.6540.392（ g）酶活性105.39104.1840.0424.506. 计算酶活性 , 以每小时每克鲜重所产生的-/h.g ）。NO微克数表示（ NO22完全培养液， KNO3酶活性 =(1.791/1)*10/0.51*(20/60)= 105.39完全培养液， H2 0酶活性 =(1.771/1)*10/0.51*(20/60)= 104.18缺 N培养液， KNO3酶活性 =(0.654/1)*10/0.49*

6、(20/60)= 40.04缺 N培养液， H2O酶活性 =(0.392/1)*10/0.48*(20/60)= 24.50将结果填入上表。四、实验结果分析在完全培养液和缺 N培养液中，加 KNO3普遍都要比加 H20 的酶活性高，说明 KNO3 为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。在完全培养液和缺 N培养液中，加 KNO3相互比较，加 H20 的相互比较， 完全培养液的酶活性都要高，说明 N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。五、思考题1. 依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影-响 NO2 的浸出量？-答：实质是以亚硝酸根（）的含量来表示的。因为可以从组织内

7、渗到外NO2NO2界溶液中并积累，因此测定反应溶液中-的含量的增加，即表明酶活性的大小。NO2-真空泵抽气影响 NO2 的浸出量。因为反复抽气放气， 溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。2. 为什么做两组溶液，一组培养液中加入 H20 和一组培养液中加入 KNO3的作用是？答：培养时做完全培养和缺 N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。实验时一组加 KNO3一组加 H2 0 是因为 KNO3为酶促反应提供底物，让反应得以彻底进行。3. 实验前要使材料经一定时间光照，其作用是？答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物。4. 小烧杯置于 30，不见光保温的原因是？答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸镁把 NO2- 还原成 NH3。暗反应下反应可阻止 NO2- 的继续反应。5