医学微生物学实验课件

1、 一一. . 实验室生物安全实验室生物安全 二二. . 细菌的接种方法细菌的接种方法 三三. . 革兰染色革兰染色 1.1.通过介绍实验室生物安全方面的相关知通过介绍实验室生物安全方面的相关知 识，树立识，树立“有菌的意识，无菌操作的观念有菌的意识，无菌操作的观念” 。 2.2.掌握革兰染色方法和细菌接种技术。掌握革兰染色方法和细菌接种技术。 3.3.观察细菌的特殊结构。观察细菌的特殊结构。 实验目的实验目的 v生物危害源生物危害源 v化学危害源化学危害源 v物理危害源物理危害源 后两者的特性：后两者的特性： 1 1、可感知，易避免、可感知，易避免 2 2、危害范围有限、危害范围有限 3 3、

2、危害持续时间短、危害持续时间短 一.实验室生物安全 医学实验室的主要危害源包括哪些医学实验室的主要危害源包括哪些? ? v惨痛的历史教训惨痛的历史教训 例一：例一：19561956年，前苏联的一个实验室曾有年，前苏联的一个实验室曾有9 9支支 装有感染了装有感染了委内瑞拉马脑炎病毒委内瑞拉马脑炎病毒的鼠脑的安的鼠脑的安 瓿被打破。由于瓿被打破。由于没采取必要的措施没采取必要的措施，结果在，结果在 几天内造成几天内造成2424名名工作人员感染。工作人员感染。 一.实验室生物安全 例二：例二：20042004年年4 4月，中国疾病预防控制中月，中国疾病预防控制中 心科研人员，采用未经论证的非典病毒

3、灭心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭 活方法，活方法，在不符合防护要求的普通实验室在不符合防护要求的普通实验室 内内操作非典感染材料，造成北京、安徽发操作非典感染材料，造成北京、安徽发 生非典疫情。生非典疫情。 一.实验室生物安全 例三例三：20102010年年1212月东北农业大学月东北农业大学 “ “羊活体解剖学实羊活体解剖学实 验验”，共，共5 5个班级个班级2828人感染人感染布鲁氏菌病布鲁氏菌病。采购人均。采购人均 未要求养殖场出具检疫合格证明，断定未经检验的未要求养殖场出具检疫合格证明，断定未经检验的 这这4 4只山羊带有布鲁氏菌。此外，导致此次感染的只山羊带有布鲁氏菌。此外，导

4、致此次感染的 原因还有原因还有: :未能切实按照实验规范，严格要求学生未能切实按照实验规范，严格要求学生 遵守操作章程，进行有效防护。遵守操作章程，进行有效防护。 一.实验室生物安全 v实验室感染的事件曾多次发生，实实验室感染的事件曾多次发生，实 验室人员曾为此付出了沉重的代价。验室人员曾为此付出了沉重的代价。 这些感染的这些感染的主要原因是：防护意识主要原因是：防护意识 不强，操作失误，防护条件不足。不强，操作失误，防护条件不足。 一.实验室生物安全 医学微生物学实验室规则医学微生物学实验室规则 v学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱

5、下反折，要 经常清洗消毒。经常清洗消毒。 v进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定 的储物柜内。的储物柜内。 v严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 v手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手； 避免有菌材料溅出；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告破损器材及时处理并报告。 v实验过程中避免一切不良的个人习惯；实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要操作中产生的废料要 扔在指定容器内扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日

6、生严格认真打扫；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫 卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。 实验室意外紧急处理办法实验室意外紧急处理办法 v1 1 皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2% 2% 碘酊碘酊 或或2%2%红汞涂抹。红汞涂抹。 v2 2 烧伤：局部涂凡士林，烧伤：局部涂凡士林，2%2%鞣酸或鞣酸或2%2%苦味酸。苦味酸。 v3 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸 氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用氢钠溶液洗涤

7、中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%2%硼硼 酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1 12 2滴滴 滴眼）。滴眼）。 v4 4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，菌液入口：立即吐入消毒容器内，1 1：10001000高锰酸钾或高锰酸钾或3%3% 双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。 v5 5 菌液污染台面：菌液污染台面：2%3% %来苏尔或来苏尔或0.1%0.1%新洁尔灭覆盖新洁尔灭覆盖3030分钟分钟 后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3 3分后肥皂和分后肥皂

8、和 清水洗净。清水洗净。 v6 6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等 有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。 二二. .无菌操作技术无菌操作技术 实验目的实验目的 1. 1. 掌握常用的细菌接种方法掌握常用的细菌接种方法 2. 2. 熟悉细菌生长现象的观察方法熟悉细菌生长现象的观察方法 概念：概念：是人工配制的专供微生物生长繁殖的是人工配制的专供微生物生长繁殖的 混合营养物制品。混合营养物制品。 成分：成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、充足的营养物质（水分、碳源、氮源

9、、 无机盐）；合适的无机盐）；合适的PHPH；适宜的温度；适宜的气体环；适宜的温度；适宜的气体环 境。境。 用途：用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代用于微生物的繁殖及分离接种，传代 或保存，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及或保存，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及 生化特性等。生化特性等。 一、培养基一、培养基 二、培养基分类二、培养基分类 按按用途用途分分 营养营养培养基：培养基：血液血液琼脂培养基琼脂培养基 基础基础培养基：培养基：普通普通琼脂培养基琼脂培养基 选择选择培养基：培养基：S-SS-S培养基培养基 鉴别鉴别培养基：培养基：双糖铁双糖铁培养基培养基 厌氧厌氧培养基：培养

10、基：庖肉培养基庖肉培养基 二、培养基分类二、培养基分类 按按物理性状物理性状分分 液体液体培养基：培养基：大量大量繁殖繁殖细菌细菌 固体固体培养基：培养基：分离鉴定分离鉴定细菌细菌 半固体半固体培养基：培养基：观察动力观察动力及保存菌种及保存菌种 v普通固体琼脂培养基接种法普通固体琼脂培养基接种法 1.平板分区划线平板分区划线接种法：分离培养细菌。接种法：分离培养细菌。 2.斜面固体培养基斜面固体培养基接种法：纯菌的移种，接种法：纯菌的移种， 短时间保存菌种。短时间保存菌种。 v半固体琼脂培养基半固体琼脂培养基穿刺穿刺接种法接种法 保存菌种或观察细菌的动力保存菌种或观察细菌的动力 v液体培养基

11、接种法液体培养基接种法 用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等。用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等。 三、细菌的接种方法三、细菌的接种方法 1.1.平板分区划线接种平板分区划线接种- -得单个菌落得单个菌落 分区划线分区划线注意事项注意事项 v划线时接种环与平皿约成划线时接种环与平皿约成30304040度角度角, ,轻轻接触轻轻接触, , 以以腕力腕力在琼脂在琼脂表面表面轻快滑动轻快滑动, ,不能划破琼脂。不能划破琼脂。 v第一次划线应占平皿面积的第一次划线应占平皿面积的1/10,1/10,以后每次划线以后每次划线 约占面积的约占面积的1/4 1/4 1/51/5。 v划线为划线为连续划线连续划线, ,不

12、能间断。应不能间断。应占满平皿。占满平皿。划线划线 不能交叉重复不能交叉重复。 v每次划完后应每次划完后应灭菌灭菌。 2.2.斜面接种法斜面接种法 3.3.液体培养基接种法液体培养基接种法 4.4.半固体培养基半固体培养基穿刺穿刺接种法接种法 四、细菌生长现象的观察四、细菌生长现象的观察 1. 1.固体培养基固体培养基- -菌落菌落 单个单个细菌分裂繁殖形成一堆肉眼可见的细菌集团。细菌分裂繁殖形成一堆肉眼可见的细菌集团。 观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度；观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度； 在血平板上还要观察溶血情况和色素等。在血平板上还要观察溶血情况和色素等。 2

13、.2.半固体培养基半固体培养基- -鞭毛鞭毛 观察细菌的动力观察细菌的动力 三. 细菌 在 液体培 养基中的生长 情 况 菌 膜 菌 沉 淀 均匀浑 浊 对照 3.3.液体培养基液体培养基 混浊生长混浊生长（大多数细菌）（大多数细菌） 沉淀生长沉淀生长（链球菌）（链球菌） 膜样生长膜样生长（专性需氧菌，（专性需氧菌， 如结核分枝杆菌）如结核分枝杆菌） 操作内容操作内容 1. 平板分区划线法。平板分区划线法。 2. 斜面培养基的接种方法。斜面培养基的接种方法。 3. 半固体培养基穿刺接种法。半固体培养基穿刺接种法。 4. 液体培养基的接种方法。液体培养基的接种方法。 三三. .细菌的形态学检查细

14、菌的形态学检查 染色标本检查染色标本检查 单染法单染法：简单染色，一种染料：简单染色，一种染料 （美蓝染色）（美蓝染色） 复染法复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、 抗酸染色）抗酸染色） 革兰染色革兰染色(Gram stain)(Gram stain) v 18841884年由丹麦细菌学家年由丹麦细菌学家GramGram创立。创立。 v 革兰染色是最常用的一种染色方法，可以革兰染色是最常用的一种染色方法，可以 将细菌初步分为将细菌初步分为革兰染色阳性菌革兰染色阳性菌和和革兰染色革兰染色 阴性菌阴性菌，在临床上具有非常重要的意义。，在临床上具有非常重要的

15、意义。 一、目的一、目的 1.1.掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法。掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法。 2.2.熟悉革兰染色的原理和临床意义。熟悉革兰染色的原理和临床意义。 一 一 半 半 结结晶紫晶紫 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 95%95%乙醇 乙醇 石碳酸复红石碳酸复红 初染 媒染 脱色 复染 凡能保留第一种染料结晶紫的凡能保留第一种染料结晶紫的蓝紫色蓝紫色的细菌叫的细菌叫 G+菌菌，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复 红的红的红色红色的细菌叫的细菌叫G-菌菌。 G+ G- 二、原理二、原理 通透性学说通透性学说 G+菌菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且

16、交联细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联 度高，脂质含量少，乙醇不易渗入。度高，脂质含量少，乙醇不易渗入。 G-菌菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度 低，含大量脂质，乙醇易渗入。低，含大量脂质，乙醇易渗入。 等电点学说等电点学说 v G+菌菌等电点等电点（pI 23） G-菌菌等电点等电点（pI 45） v在相同在相同pH条件下条件下G+菌菌所带负电荷比所带负电荷比G-菌菌 多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较 牢固，不易脱色。牢固，不易脱色。 三、器材和试剂三、器材和试剂 1.1.菌种：菌种：白色葡萄球菌白色葡萄球菌 大肠杆

17、菌大肠杆菌 2.2.试剂：试剂： 革兰染色液革兰染色液 初染液初染液 结晶紫结晶紫 媒染液媒染液 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 脱色液脱色液 95%95%乙醇乙醇 复染液复染液 稀释石碳酸复红稀释石碳酸复红 3.3.其它：其它：接种环接种环 载玻片载玻片 染色盘染色盘 洗液瓶洗液瓶 酒精灯等酒精灯等 冲洗冲洗 3、使用油镜观察实验结果、使用油镜观察实验结果 四、四、方法与步骤方法与步骤 1、细菌涂片的制备、细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2、染色、染色 初染初染（结晶紫）（结晶紫） 媒染媒染（卢戈氏碘液）（卢戈氏碘液） 脱色脱色 （95%乙醇）乙醇） 复染复染（稀释石碳酸复红）（稀释石碳

18、酸复红） 吸水纸吸干吸水纸吸干 1min 1min 30s30s 冲洗冲洗 冲洗冲洗 冲洗冲洗 一 一 半 半 G+菌菌 G-菌菌 结晶紫结晶紫 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 95%95%乙醇 乙醇 石碳酸复红石碳酸复红 初染 媒染 脱色 复染 五、结果五、结果 图一图一 图二图二 v无菌操作（接种环灭菌和取菌）无菌操作（接种环灭菌和取菌） v涂片的厚度要适中涂片的厚度要适中 v染色的时间控制，一一半半染色的时间控制，一一半半 v冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗 六、注意事项六、注意事项 七、意义七、意义 1 1、鉴别细菌、鉴别细菌 2 2、研究与致病性、研究与致病性 的关

19、系的关系 3 3、指导临床用药、指导临床用药 G+菌菌 G-菌菌 G+菌：菌： 外毒素外毒素 G-菌菌： 内毒素内毒素 G+菌：菌：青霉素、头孢菌素等青霉素、头孢菌素等 G-菌：菌：链霉素、庆大霉素等链霉素、庆大霉素等 细菌的特殊结构（示教）细菌的特殊结构（示教） （二毛荚一胞）（二毛荚一胞） 从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。 功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H H抗原）抗原） 比鞭毛更细、短、直、硬比鞭毛更细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属

20、物，与运多的丝状蛋白附属物，与运 动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛 功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质 菌体内部物质缩水（菌体内部物质缩水（6060） 形成圆或卵圆形小体。形成圆或卵圆形小体。 功能：芽胞形态辨细菌，功能：芽胞形态辨细菌， 灭菌标准抗力强。灭菌标准抗力强。 寻找视野：寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜 观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中 心。心。 增大光照强度：增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开将聚光器上升到最高位置，光圈开 到最大，凹面镜取光。到最大，凹面镜取光。 转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，转动转换器， 使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上 滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油 镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜 头浸入油中