固相析出分离法

1、固相析出分离法 药物化学 苏元元 目的：目的： (浓缩；浓缩； (初步纯化初步纯化 ； (将已纯化的将已纯化的产品由液态变成固态产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。，加以保存或进一步处理。 固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前 仍广泛应用在工业上和实验室中。仍广泛应用在工业上和实验室中。 概述 n固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质 存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从 溶液中分离的操作技术。 n 固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除 去不溶性杂质及细胞碎片）以后

2、进行，得到的沉去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉 析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且 易于放大，也广泛用于生产的制备过程，易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常 用的方法。用的方法。 盐析法 有机溶剂沉淀法 固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法 n结晶法

3、：析出物为晶体。 n沉淀法：析出物为无定形固体。 固相析出法分类固相析出法分类 n第一节 盐析法 n第二节 有机溶剂沉淀法 n第三节 其它沉淀方法 n第四节 结晶 第一节 盐析法 n一、基本原理 n二、影响因素 n三、盐析操作 定义：盐析法是利用各种生物定义：盐析法是利用各种生物 分子分子在浓盐溶液中溶解度的在浓盐溶液中溶解度的 差异差异，通过向溶液中引入一，通过向溶液中引入一 定数量的中性盐，使定数量的中性盐，使目的物目的物 或或杂蛋白杂蛋白以沉淀以沉淀析出析出，达到，达到 纯化目的的方法。纯化目的的方法。 优点：简单、经济、较少变性优点：简单、经济、较少变性 缺点：分辨率不高；沉淀含大缺点

4、：分辨率不高；沉淀含大 量盐析剂，要除盐；产生氨量盐析剂，要除盐；产生氨 的恶臭的恶臭 7 两种现象：两种现象： 盐溶盐溶：低盐情况，：低盐情况， 盐离子强度的增盐离子强度的增 高，蛋白质溶解高，蛋白质溶解 度增大度增大 盐析盐析：高盐，盐离：高盐，盐离 子强度增加，蛋子强度增加，蛋 白质白质溶解度减小溶解度减小 8 2021-7-16南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院9 2021-7-16南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院10 一、基本原理一、基本原理 11 盐析作用（salting out）原理 n破坏双电层： q在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质

5、 表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减 弱而能相互聚集起来。 n破坏水化层： q中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水 化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由 于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L； 盐离子强度盐离子强度, , C Ci ii i离子浓度，离子浓度，mol/Lmol/L； Z Zi ii i离子化合价；离子化合价； 常数常数, ,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距; ; K Ks s盐析常数盐析常数。 13 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 -1.0 -

6、1.5 1 2 3 4 5 6 logS S0 盐析和盐析和K KS S盐析盐析 右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系 曲线，在盐析区，符合公式 n两种类型：两种类型： （1 1）在一定的）在一定的pHpH和温度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度） 进行盐析，称作进行盐析，称作KsKs盐析法盐析法。 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生 共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 （2 2）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变pHpH和温度进行盐析，和温度进行盐析， 称作称作盐析法盐析

7、法。 由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此 分辨率更高，后期分离（结晶）分辨率更高，后期分离（结晶） 14 二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素 1.无机盐的种类 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ： 柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42- 2- CHCH3 3COOCOO-

8、 - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- - 阳离子盐析效果：阳离子盐析效果： NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子 l盐析用盐的选择 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 u（1 1） 价廉价廉 ； u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他

9、盐好， u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。 n缺点： n（1）水解变酸； n（2）高pH 释氨，腐蚀； n（3）残留产品有影响。 n不同种类蛋白质所需的无机盐量不同 n先后加入不同量无机盐分级沉淀蛋白质 2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、 血 纤 维 蛋 白 原 碳 氧 血 红 蛋 白 血 清 白 蛋 白 拟 球 蛋 白 碳 氧 肌 红 蛋 白 0.50 0 -0.50 -1.00 0 2 4 6 8 10 log S 不同蛋白溶解度与离子强度的关系 盐析分布曲线盐析分布曲线 19 n蛋白质浓度不同：所需无 机盐用量不同 n蛋白质浓度高：所需无机 盐量少 n制成品：可适当高浓

10、度， 但浓度过高，易共沉淀 n重叠蛋白分级：适当稀释， 共沉淀小，但回收率降低。 3.溶质（蛋白质等）浓度：23% - d d S P 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 40 50 60 70 80 P 30g/L 3g/L 不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线 n无机或稀盐溶液：T蛋 白质溶解度 n高盐溶液： T蛋白质溶 解度 n蛋白质：室温盐析 n对温度敏感的酶， 0C4C 4.温度： 2 1 0 log S 2 3 4 25 0 pH6.6 温度对溶解度的影响 5.pH： nPl盐析 n注意高盐下pl的偏移： 与负离子结合向低 pH偏移，与正离子 结合向高pH偏移 n利用蛋白质

11、pl的不同： 可分级沉淀蛋白质 卵清蛋白 碳氧血红蛋白 7 6 5 4 3 2 1 0 3 4 5 6 7 8 pH 三、盐析操作三、盐析操作 1.盐析用盐的浓度表示 硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法： 1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况； 工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅 拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不

12、高而原来溶液体积不大的情用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情 况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵 中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。 该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐， 故多用于结晶。故多用于结晶。 盐析用盐量的盐析用盐量的表征

13、表征- - -饱和度：饱和度： u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度 或饱和浓度可通过实验确定。或饱和浓度可通过实验确定。 u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度都小于饱和度时，溶解度都小于 0.l mg0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作 范围在范围在40%-60%40%-60%之间。之间。 调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表 n盐析方法： l1）分步盐析法(不同的盐浓度) l2）重复盐析法 l高蛋白质浓度下共沉淀重复盐析提高纯度

14、l3）反抽提法(相同盐浓度) 2、盐析方法和注意事项 n分级盐析法 n不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀 n低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物 血清血清 球蛋白球蛋白 清蛋白清蛋白 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 50%50%饱和度饱和度 饱和饱和 析出析出析出析出 单酶盐析曲线 双酶盐析曲线 n反抽提法 n共沉淀较低浓度盐溶液溶杂蛋白 大肠杆菌RNA聚合酶的制备 n防止“局部过浓”：慢加，搅拌 n温度：不宜过低，室温1025C，易失活： 010C n时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离 注意事项： 第二节 有机溶剂沉淀法 一、基本原理 二、影响沉淀效果的因素 l有机

15、溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖 和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早 使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。 l优点：优点： l1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀；窄的有机溶剂浓度下沉淀； l2 2）溶剂易除去）溶剂易除去 l3 3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； l缺点：缺点： l1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， l2 2）操作要求在

16、低温下进行。）操作要求在低温下进行。 l3 3）成本高，）成本高，需需防火防爆防火防爆 l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如 盐析法普遍。盐析法普遍。 一、基本原理 n1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间 的静电引力增加，聚集形成沉淀。 n 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自 由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水 化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝 集。 n脱水作用比静电作用强 一些溶剂的介电常数一些溶剂的介电常数 35 二、影响沉淀效果的因素 1.有机溶剂种类及用量 n能与水无限混溶 n介电常数小、沉淀强 n变性小 n毒性小，

17、挥发性适中 常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲 醇（口服毒性） 介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核 酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 用量：（了解） 2.pH的影响 nPl附近、稳定性 n控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子 带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导 致共沉淀。 n严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应 q预冷（有机溶剂-10以下，蛋白质0左右）， q在冰盐浴中进行， q加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓 变性，并散热。 n温度影响有机溶

18、剂对蛋白质的沉淀能力，一般 温度越低，沉淀越完全。 3.温度 n低浓度缓冲液（0.01-0.05mol/L），0.2mol/L）：盐溶，增大蛋白质在 有机溶剂水溶液中的溶解度，会增加溶媒用量， 沉淀物中可能夹带盐，需除盐 q常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 4.无机盐的含量 5.某些金属离子的助沉淀作用 nZn、Cu等与呈阴离子状态的蛋白质形成复合 物，而活性不变，有助于沉淀，降低有机溶剂 用量。 n胰岛素精制：胰岛素精制： 6.样品浓度 n较稀：溶剂量，收率，稀释变性 n较高：共沉淀，分辨率，溶剂量，回收率， 变性小 n蛋白质初浓度：0.5%2% n粘多糖：12% 举例：固体发酵生产

19、举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影响影响 收率收率% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 适宜的适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响温度影响 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 适宜的温度适宜的温度10 20 第三节 其它沉淀方法 n一、等电点沉淀 n二、成盐沉淀法 n三、亲和沉淀 n四、高分子聚合物沉淀法 n五、表面活性剂沉淀法 一、等电点沉淀法 原理： nPl时分子表面静电荷

20、为零，双电层及水化膜的削 弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。 n常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起 配合使用。 n主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 二、成盐沉淀法 n1.金属离子沉淀 n所用的金属离子，包括MnMn2+ 2+、 、FeFe2+ 2+、 、CoCo2+ 2+、 、NiNi2+ 2+、 、 ZnZn2+ 2+、 、CaCa2+ 2+、 、BaBa2+ 2+、 、MgMg2+ 2+等。 n蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基 和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐 复合物。 n分离沉淀复合物分解除金属离子（离子交换 或金属螯合剂EDTA） n应用： 目的蛋

21、白分离，去杂质 n缺点：有时复合物分解较困难，蛋白质 易变性 2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能 够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析 出。 工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温 和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋 白质变性。 n单宁：结合后牢固，竞争结合法分解 n雷凡诺：不影响蛋白质活性 n三氯乙酸（TCA）：变性，除杂蛋白 雷凡诺雷凡诺 n 猪心提取液猪心提取液 洗脱液洗脱液 上清液上清液 上清上清 细胞色素细胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除） 吸附 人造沸石 盐析 45%饱和硫酸铵 沉淀 TCA 透析 三、亲和沉淀法 n配基+可溶性载体偶联成载体-

22、配基复合物（亲 和沉淀剂） n可选择性地与蛋白质结合而沉淀出来 u它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配 位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用 而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。 u所以所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异， 而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解有特殊蛋白质的聚合物的溶解 度的大小。度的大小。 亲亲 和和 沉沉 淀淀 过程过程 n亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单亲和过程提供了

23、一个从复杂混合物中分离提取单 一产品的有效方法。一产品的有效方法。 初始阶段，将一个目标初始阶段，将一个目标蛋白质蛋白质与键合在可溶性载与键合在可溶性载 体上的体上的亲合配位体亲合配位体络和形成沉淀；络和形成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗洗 去去可能存在的可能存在的杂质杂质； 用一种适当的试剂将用一种适当的试剂将目标蛋白质目标蛋白质从配位体中离解从配位体中离解 出来。出来。 四、高分子聚合物沉淀法 n水溶性非离子型高分子聚合物能使蛋白质水合作 用减弱而发生沉淀。 nPEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖 n双水相或单高聚物 q其中应

24、用最多的是聚乙二醇。 n无毒，对产品的影响小，但不易除去 56 五、表面活性剂沉淀法 nCTAB （十六烷基三甲基季胺溴化物） 、CPC (十六烷基氯化吡啶) ：沉淀酸性多糖 n与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络 合物析出。 nSDS：分离胰蛋白或核蛋白 q目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则 存在于水溶液中。 讨论：咸鸭蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这 是什么缘故？ n熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达3131，为什么看，为什么看 不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常 可以看到黄色的油滴往外流？可以看到黄色

25、的油滴往外流？ n蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质 就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散 成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。 n在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳 浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就 互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋 滋的，甚至流出油来了

26、。滋的，甚至流出油来了。 第四节 结晶 n定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则 的排列而结合成晶体。 q只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有 良好的选择性。 q通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、 洗涤可得到纯度高的晶体。 一、结晶过程 二、过饱和溶液的形成 三、提高晶体质量的途径 n饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等 条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液； n过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶 液称之为过饱和溶液； n溶质只有在过饱和溶液中才能析出； 一、结晶过程 1.概念 n推动力： q形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液 浓

27、度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质 浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。 n晶核： q最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。 q首先形成晶核，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上， 在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的 动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才 能够稳定存在。 2.晶体的形成 结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成 新相的过程。条件： 过程： n形成过饱和溶液 n晶核形成 n晶体生长 3.结晶曲线 n稳定态：不沉淀结晶 n亚稳定态：不自动生 产结晶，加入晶体能 诱导结晶。控制条件， 让晶体缓慢长大。 n不稳定态：自动沉淀 结晶，大量细小结

28、晶 结晶操作通常都在亚稳区中进行结晶操作通常都在亚稳区中进行 4.起晶方法 自然起晶自然起晶 n把溶液蒸发把溶液蒸发 浓缩至过饱浓缩至过饱 和区（不稳和区（不稳 定区），则定区），则 有大量晶核有大量晶核 自然形成。自然形成。 n但晶核数量但晶核数量 难以控制，难以控制， 晶粒小。晶粒小。 刺激起晶刺激起晶 n把溶液蒸发至接近过饱和把溶液蒸发至接近过饱和 线后把溶液放出，使溶液线后把溶液放出，使溶液 突然冷却，进入过饱和区突然冷却，进入过饱和区 形成大量晶核。形成大量晶核。 n当晶核达到一定数量后，当晶核达到一定数量后， 回升温度，使溶液进入介回升温度，使溶液进入介 稳区，停止晶核产生，然稳区

29、，停止晶核产生，然 后再慢慢冷却，同时搅拌，后再慢慢冷却，同时搅拌， 使晶核长大。使晶核长大。 晶种起晶晶种起晶 n将溶液浓缩到介稳定区将溶液浓缩到介稳定区 的饱和浓度后，加入一的饱和浓度后，加入一 定大小和数量的晶种，定大小和数量的晶种， 同时均匀搅拌，使晶体同时均匀搅拌，使晶体 长大。长大。 n优点：控制方便，产品优点：控制方便，产品 晶体大小均匀。晶体大小均匀。 二、过饱和溶液的形成（结晶方法） 1.蒸发法 q蒸发除去部分溶剂，在常压或减压下加热除去一部 分溶剂，以达到或维持过饱和度。 q适用于小分子化合物的结晶，受热变性的蛋白质或 酶类不宜采用。 2.温度诱导法 n通过升高或降低温度，

30、使溶液逐渐达到饱和， 可缓慢析出晶体。 n热盒技术 n耐热生化物质高温溶解温度逐渐下降析出 晶体 3.盐析结晶法 n固体盐粉末、饱和 盐溶液（中性盐） n蛋白质及酶类药物 制备中常用方法 4.透析结晶法 72 使溶解度的变 化连续又缓慢 5.有机溶剂结晶 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、异丙醇、乙 腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。 蛋白质变性 溶剂回收 6.等电点结晶 7.微量扩散法 n通过气相扩散使样品中溶质达到饱和晶体 8.化学反应结晶法 n调pH或加反应剂生成新物质结晶 其实质是利用化学 反应，对待结晶的 物质进行修饰，一 方面可以调节其溶 解特性，同时也可 以进行适当的保护

31、； 9.共沸蒸馏结晶 n共沸物的共沸点 n真空下共沸点 n真空低温下进行共沸蒸馏结晶 n常多种方法综合应用 n工业上通常希望得到工业上通常希望得到粗大而均匀粗大而均匀的晶体，便于的晶体，便于 过滤与洗涤。过滤与洗涤。 n晶体质量包括三个方面的内容：晶体质量包括三个方面的内容： 晶体大小、形状和纯度晶体大小、形状和纯度 三、提高晶体质量的途径 n1）过饱和度 q过饱和度值应大至使结晶操作控制在过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区亚稳区内，又内，又 保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。 n2）温度（缓慢冷却） 1.1.晶体大小晶体大小 快速冷却或蒸

32、发快速冷却或蒸发 大量细小的晶体大量细小的晶体 缓慢冷却或蒸发缓慢冷却或蒸发 大而均匀的晶体大而均匀的晶体 n3）搅拌速度：适当，不宜太快 搅拌的作用搅拌的作用: : 加速溶液的热传导，加快生产过程。加速溶液的热传导，加快生产过程。 加速溶质扩散过程的速率，有利于晶体成长。加速溶质扩散过程的速率，有利于晶体成长。 使溶液的温度均匀，防止溶液局部浓度不均，结垢等。使溶液的温度均匀，防止溶液局部浓度不均，结垢等。 使晶核散布均匀，防止晶体粘连在一起形成晶簇，降低产品质量使晶核散布均匀，防止晶体粘连在一起形成晶簇，降低产品质量。 n4）晶种：诱导结晶，控制晶体形状大小均匀度 2.2.晶体形状晶体形状

33、 n晶体生长速度 n过饱和度 n溶剂 npH： pH的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分 子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的pH 与沉淀大致相 同。 n杂质 3.3.晶体纯度晶体纯度 n母液中的杂质 n晶体越细小，杂质越多 n洗涤有利提高纯度 n结晶速度过快，易产生“晶蔟”，包含杂质 杂质杂质对对晶体的成长晶体的成长速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体 的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。 4.4.晶体结块晶体结块 n原因： n粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存 时间增长 n措施： n

34、控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存 5.5.重结晶重结晶 n晶体用合适溶剂溶解后再 次结晶，提高纯度 n用于生物物质重结晶的溶 剂一般有蒸馏水、丙酮、 石油醚、乙酸乙酯、低级 醇等。 n结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的 一种有效手段一种有效手段。变性蛋白质不能结晶，所。变性蛋白质不能结晶，所 以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。 2021-7-16南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院842021-7-1684南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院 谷氨酸结晶谷氨酸结晶 固相析出法的应

35、用固相析出法的应用 例例1 1：尿激酶的沉淀分离：尿激酶的沉淀分离 n尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸 附法、层析法附法、层析法 n沉淀法：沉淀法： q金属离子形成复合盐金属离子形成复合盐 q脱盐脱盐 q盐析盐析 Zn Zn 离子沉淀尿激酶离子沉淀尿激酶 低浓度时低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。能选择沉淀尿激酶。 在在3mM可得可得85-92 回收率，而沉回收率，而沉 淀物的量并不多；淀物的量并不多； 加大加大Zn 浓度浓度虽然能提高有限回收虽然能提高有限回收 率，但沉淀物量大，纯度降低。率，但沉淀物量大，纯度降低。 沉淀量沉淀量 酶活酶活 EDTA 溶出效应 硫

36、酸铵溶解尿激酶锌络合物 n硫酸铵的选用硫酸铵的选用 n1) 1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解；白溶解； n2)2)因为本身有因为本身有NHNH4 4+ +，与，与Zn Zn 2+ 2+有络合作用，有 有络合作用，有 利利 于沉淀物溶解；于沉淀物溶解； n3)3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。加规定量即可，而不引入其他成分。 尿激酶盐析沉淀尿激酶盐析沉淀 沉淀量沉淀量 回收率回收率 纯度纯度 例例2：柠檬酸的生产：柠檬酸的生产 n柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食

37、品、医药、化工、柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、 皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。 n目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉） 生产，生产， n提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀 及硫酸酸解）及硫酸酸解） 标准沉淀法回收柠檬酸流程图标准沉淀法回收柠檬酸流程图 加热到加热到70度度 pH1.82.0 过滤 例例3：胰蛋白酶的提取：胰蛋白酶的提取 从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺 u胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下

38、稳定胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定 u溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8)pI10.8) u浓缩分离胰蛋白酶原（盐析）浓缩分离胰蛋白酶原（盐析） u溶解激活（酶原溶解激活（酶原- -酶）酶） u胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等 与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同 胰蛋白酶的提取胰蛋白酶的提取 （二）胰蛋白酶原激活（二）胰蛋白酶原激活 o滤饼溶解滤饼溶解, , 加入无水加入无水CaClCaCl2 2, ,边加边搅拌边加边搅拌, ,最终含有最终含有0.1M Ca

39、Cl0.1M CaCl2 2； o5MNaOH5MNaOH调调pHpH至至8.0,8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8 81010小时；小时； A.A.活化完成，用活化完成，用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4调调pHpH至至2.5-3.02.5-3.0，抽滤除去，抽滤除去CaSOCaSO4 4沉淀。沉淀。 （一）猪胰蛋白酶原的提取（一）猪胰蛋白酶原的提取 胰脏绞碎加入胰脏绞碎加入2 2倍体积冷乙酸倍体积冷乙酸 (pH2.5)(pH2.5)低温搅拌低温搅拌2424小时，过滤；小时，过滤； 滤液用滤液用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4调调pHpH至至2.52.53.03.0，放置，放置3 34 4小时后，用滤纸过滤；小时后，用滤