选修121微生物的实验室培养

1、 到目前为止，到目前为止， 几十项诺贝尔生理或医学奖，化学奖几十项诺贝尔生理或医学奖，化学奖 都与微生物学有关都与微生物学有关 微生物微生物 的类群的类群 原生生物：原生生物： 原核生物原核生物: : 真菌真菌: : 病毒病毒 如酵母菌如酵母菌 单细胞的动植物单细胞的动植物 如草履虫、单细如草履虫、单细 胞藻类等胞藻类等 无细胞结构：无细胞结构： 真真 核核 细细 胞胞 细菌、蓝藻细菌、蓝藻 原核细胞原核细胞 有细胞有细胞 结构结构 课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养 1.1.提供营养和条件提供营养和条件 2.2.防止污染防止污染 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和

2、营养物质微生物生存的环境和营养物质 1.1.基本成分：基本成分： 思考：微生物“吃”什么？ 碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐 碳源碳源 无机碳源：无机碳源： 有机碳源：有机碳源： COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物自养微生物 异养微生物异养微生物 氮源氮源 无机氮源：无机氮源： 有机氮源：有机氮源： NHNH4 4 、 、NONO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素 等等 注：含注：含C C、H H、O O、N N的的有机物有机物是是异异养型微生物的：养型微生物的： 碳

3、源碳源、氮源氮源、能源。能源。 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质 2.2.特殊营养：特殊营养：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等维生素（如乳酸杆菌）、碱基等 （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 3.pH3.pH、氧气的需求：、氧气的需求：霉菌（ 霉菌（pHpH调至酸性）调至酸性） 细菌（细菌（pHpH调至中性或微碱性）调至中性或微碱性） 厌氧生物需提供无氧条件。厌氧生物需提供无氧条件。 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质 4.4.培养基种类培养基种类 固体培养基固体培养基液体培养基

4、液体培养基 有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂 分离分离 鉴定鉴定 工业工业 生产生产 化学成分：化学成分： 物理性质：物理性质： 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 划分标准划分标准培养基种类培养基种类特点特点用途用途 物理性质物理性质 化学成分化学成分 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 用途用途 鉴别培养基鉴别培养基 培养基的种类培养基的种类 不加凝固剂不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂加凝固剂，如琼脂 工业生产工业生产 观察微生物的运动、观察微生物的运动、 分类鉴定分类鉴定 微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、 活菌计数、保藏菌活菌计数、保藏菌 种种 含化学成分不明确的天然物含化

5、学成分不明确的天然物 质质 工业生产工业生产 培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定 在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物 质质, ,以抑制不需要的微生物以抑制不需要的微生物 的生长的生长, ,促进所需要的微生促进所需要的微生 物的生长物的生长 培养、分离出特培养、分离出特 定微生物定微生物 在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂 或化学药品或化学药品, ,用以鉴别不同用以鉴别不同 种类的微生物种类的微生物 鉴别不同种类微鉴别不同种类微 生物生物 液体培养基液体培养基 半固体体培养基半固体体培养基 固体体培养基固体体培养基 选择培养基选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养

6、基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。 1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至定容至1000ml NaCl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 琼脂琼脂20.0g 5. 5. 配制原则配制原则 目的明确：目的明确： 营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当 适宜的适宜的pHpH值：值： 有机碳源有机碳源异养型：异养型： 根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料 自养型：自养型： 不加碳源不加碳源 加入缓冲剂加入缓冲剂 细菌偏

7、碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸 （COCO2 2碳源）碳源） 生产生产科研科研 耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时 接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具 7075、30min 80、15min 100、56min 消毒消毒灭菌灭菌 定义定义 方法方法 较为较为温和温和理化方法，理化方法， 杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体 （不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子） 强烈强烈的理化方法，的理化方法， 杀死杀死所有微生物所有微生物 （包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子） 煮沸消毒法煮沸消毒法 巴氏消毒法巴氏消毒法 化学药剂化学药剂 紫外线紫外线 灼烧

8、灭菌灼烧灭菌 干热灭菌干热灭菌 酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 培养基，培养基， 100KPa、 121、1530min 二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染 1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌： 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或 灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿 （2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手 2.2.无菌范围：无菌范围

9、：实验操作空间消毒实验操作空间消毒 操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒 实验用具灭菌实验用具灭菌 实验操作过程实验操作过程 二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染 1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌： 酒精灯旁操作酒精灯旁操作 超净工作台超净工作台 单个单个 或少数菌体或少数菌体 2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。颜色、透明度等。 3.3.功能：功能： 1.1.定义：定义： 三三. .菌落菌落 鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据 固体固体培养基上培养基上 大量繁殖大量繁殖 子细胞群体子细胞群体 1000ml1000ml

10、牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至定容至1000ml NaCl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 琼脂琼脂20.0g 四四. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量 依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量 2.2.称量：称量： 3.3.溶化：溶化： 牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖 牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸 蛋白胨、蛋

11、白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容 4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口： 5.5.灭菌：灭菌： 6.6.倒平板：倒平板： 培养基、培养皿培养基、培养皿 分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形成单个菌落 约约50 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 灼烧灭菌，灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基 二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌： 平板划线法：平板划线法： 菌种菌种 划划3 3个平板个平板 1 1

12、个不划线个不划线 1.1.接种：接种： 接种环接种环 防止划破培养基防止划破培养基 （重复实验）（重复实验） （空白对照）（空白对照） 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都为什么在操作的第一步以及每次划线之前都 要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要 灼烧接种环吗？为什么？灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划

13、菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐 减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。环境和感染操作者。 6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水 1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液： 菌液菌液 微量微量 移移 液器液器 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： a.a.梯度

14、稀释菌液：梯度稀释菌液： b.b.涂布平板：涂布平板： 不超过不超过0.1ml0.1ml 各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板 1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照 滴滴 灼灼 试试 涂涂 稀稀 释释 10103 3 倍倍 稀稀 释释 10104 4 倍倍 稀稀 释释 10105 5 倍倍 平板划线法：平板划线法： 二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌： 1.1.接种：接种： 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： 2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的

15、培养基的培养基 放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后， 观察并记录观察并记录 三三. .菌种的保藏：菌种的保藏： 1.1.临时保藏：临时保藏： 试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上 44 2.2.长期保存：长期保存： 菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异 甘油管藏甘油管藏 1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液 2020 稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液： b.b.涂布平板：涂布平板： 滴稀释菌液滴稀释菌液 不超过不超过0.1ml0.1ml 各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板 1 1个不涂布作空白对照个不涂布作

16、空白对照 稀稀 释释 10103 3 倍倍 稀稀 释释 10104 4 倍倍 稀稀 释释 10105 5 倍倍 一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质 4.4.培养基种类培养基种类 固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基 有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂 分离分离 鉴定鉴定 工业工业 生产生产 化学成分：化学成分： 物理性质：物理性质： 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 划分标准划分标准培养基种类培养基种类特点特点用途用途 物理性质物理性质 化学成分化学成分 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 用途用途 鉴别培养基鉴别培养基 培养基的种

17、类培养基的种类 不加凝固剂不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂加凝固剂，如琼脂 工业生产工业生产 观察微生物的运动、观察微生物的运动、 分类鉴定分类鉴定 微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、 活菌计数、保藏菌活菌计数、保藏菌 种种 含化学成分不明确的天然物含化学成分不明确的天然物 质质 工业生产工业生产 培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定 在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物 质质, ,以抑制不需要的微生物以抑制不需要的微生物 的生长的生长, ,促进所需要的微生促进所需要的微生 物的生长物的生长 培养、分离出特培养、分离出特 定微生物定微生物 在培养基中加入某种指示剂在培养基

18、中加入某种指示剂 或化学药品或化学药品, ,用以鉴别不同用以鉴别不同 种类的微生物种类的微生物 鉴别不同种类微鉴别不同种类微 生物生物 液体培养基液体培养基 半固体体培养基半固体体培养基 固体体培养基固体体培养基 选择培养基选择培养基 耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时 接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具 7075、30min 80、15min 100、56min 消毒消毒灭菌灭菌 定义定义 方法方法 较为较为温和温和理化方法，理化方法， 杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体 （不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子） 强烈强烈的理化方法，的理化方法， 杀死杀死所有微生物所有微生物 （包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子） 煮沸消毒法煮沸消毒法 巴氏消毒法巴氏消毒法 化学药剂化学药剂 紫外线紫外线 灼烧灭菌灼烧灭菌 干热灭菌干热灭菌 酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 培养基，培养基， 100KPa、 121、1530min 二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染 1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌： 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或 灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1 1） 培养细菌