课件单克隆抗体

1、McAb and PcAb 杂交瘤技术杂交瘤技术的诞生的诞生 1975年年8月月7日日,Kohler和和Milstein在英国自在英国自 然杂志上发表了题为然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体分泌具有预定特异性抗体 的融合细胞的持续培养的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity） 1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖年度荣获诺贝尔生理学和医学奖 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）: :细胞融合剂细胞融合剂, ,使免疫的小鼠脾细使免疫的小鼠脾细 胞与小

2、鼠骨髓瘤细胞融合胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HATHAT培养基的选择培养培养基的选择培养: :反复的免疫学检测筛选克隆反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤化增殖的杂交瘤细胞系细胞系 单克隆抗体生成单克隆抗体生成: :接种杂交瘤接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔细胞于小鼠腹腔, ,腹水腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体中即可得到高效价的单克隆抗体 抗体种类抗体种类: : 第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体 （polyclonalantibody) 第二代抗体第二代抗体单克隆抗体单克隆抗体 （monoclonalantibody) 第三代抗体第三代抗体基因工程抗体基因工程抗体 （geneticeng

3、ineeringantibody) B B淋巴细胞淋巴细胞: :寿命短寿命短, ,分泌特分泌特 异系性抗体异系性抗体 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞: :寿命长寿命长 杂交瘤细胞杂交瘤细胞: :寿命长寿命长, ,单单 隆抗体隆抗体 流流 程程 不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同 （一）小鼠骨髓瘤细胞（一）小鼠骨髓瘤细胞 小鼠骨髓瘤细胞系均来源小鼠骨髓瘤细胞系均来源于于BALB/c小鼠小鼠,大鼠骨髓瘤细大鼠骨髓瘤细 胞都来源于胞都来源于LOU/c大鼠大鼠 建立的骨髓瘤细胞系建立的骨髓瘤细胞系 : SP2/0-Ag14

4、, X63-Ag8.653 NSO/1 动动物物: BALB/BALB/c c小鼠小鼠 4 48 8周龄周龄 20g20g25g25g体重体重 （二）免疫脾细胞（二）免疫脾细胞 细胞性抗原细胞性抗原: : （1 12 2）10107 7/ /只只, ,不加佐剂不加佐剂, ,2 23 3周重复一次周重复一次 可溶性抗原可溶性抗原: : 首次首次, ,完全福氏佐剂完全福氏佐剂+100+100微克抗原微克抗原, ,3 36 6周周100100200200微微 克抗原克抗原, ,融合前融合前3 3天天, ,加强免疫加强免疫 体内免疫法体内免疫法-免疫原性强、来源充分的抗原免疫原性强、来源充分的抗原,对

5、于免对于免 疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗 原就不适用了原就不适用了 免疫小鼠免疫小鼠 。 淋巴细胞淋巴细胞 。 浆细胞浆细胞 。 抗原接种抗原接种 免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接种次数接种次数 间隔时间隔时 间间 单抗的特性单抗的特性 抗体滴度抗体滴度亲和性亲和性 免疫原性强免疫原性强 （如细胞、细（如细胞、细 菌和病毒等）菌和病毒等） 10106 6-10-107 7个细胞个细胞 或或1-10ug1-10ug 2-42-42-42-4周周高高中等至强中等至强 免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42

6、-42-4周周中等或高中等或高中等或强中等或强 免疫原性弱免疫原性弱 A.20-400ugA.20-400ug2-42-4 随后随后 2-32-3 每月每月 2-32-3月月 中等中等强强 B.10-50ugB.10-50ug 其后其后 200-400ug200-400ug 2 2 其后其后 4 4 每月每月 每天每天 中等中等中等中等 C.10-100ugC.10-100ug2 2 其后其后 4 4 其后其后“休息休息” 最后加强最后加强 每月每月 1010天天 1-21-2月月 中等中等中等或强中等或强 表表6-1 不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序 （引自刘秀梵（引自刘秀梵,1

7、994） 培养液培养液: RPM1640培养液培养液 DMEM培养液培养液 （三）细胞融合（三）细胞融合 细胞融合剂细胞融合剂: PEG:分子量分子量4000的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂 作用机理作用机理:诱导细胞膜上脂类物质结构重排诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞膜易使细胞膜易 打开而有助于细胞融合打开而有助于细胞融合 作用特点作用特点: :随机发生的随机发生的, ,不同厂商、批号、分子量的不同厂商、批号、分子量的PEGPEG, , 其纯度与毒性有所不同其纯度与毒性有所不同 最早仙台病毒被用做融合剂最早仙台病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇（后来发现聚乙二醇（PEG

8、）的融合效果更好）的融合效果更好, 且避免了病毒的污染问题且避免了病毒的污染问题 培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞: : 选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态细胞形态: :浑圆、透亮、均一、排列整齐浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖避免细胞返祖: :定期用定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞 注意事项注意事项: :切忌过多传代培养切忌过多传代培养, ,可将细胞分装冻存于可将细胞分装冻存于- - 8080或液氮及干冰中或液氮及干冰中 取已经免疫的取已经免疫的BALB/c小鼠小鼠,摘除眼球采血摘除眼球采血,并分离血清并分离血清 作为抗体检测时的阳性对照血清

9、。作为抗体检测时的阳性对照血清。 同时通过颈脱位致死小鼠同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于浸泡于75%酒精中酒精中5分钟分钟 通常每只小鼠通常每只小鼠1108-2.5108个脾细胞个脾细胞,每只大鼠脾每只大鼠脾 脏可得脏可得5108-10108脾细胞。脾细胞。 免疫脾细胞的制备免疫脾细胞的制备: : 1 110108 8的的淋巴细胞淋巴细胞 无菌手术无菌手术 常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨 噬细胞噬细胞 其中其中MQMQ还有清除死亡细胞的作用还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周周, ,不影响杂交瘤细胞的纯化不

10、影响杂交瘤细胞的纯化 在细胞融合后选择性培养过程中在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细由于大量骨髓瘤细 胞和脾细胞相继死亡胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞此时单个或少数分散的杂交瘤细胞 多半不易存活多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被这种被 加入的活细胞称为加入的活细胞称为饲养细胞（饲养细胞（Feeder cells）。）。 饲养细胞饲养细胞: : 。 饲养细胞饲养细胞 融合方法融合方法 a、将、将1108脾细胞与脾细胞与2107-5107骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支混合于一支50ml融合融合 管中

11、管中,补加不完全培养基至补加不完全培养基至30ml,充分混匀。充分混匀。 b、1000r/min离心离心5-10分钟分钟,将上清尽量吸净。将上清尽量吸净。 c、在手掌上轻击融合管底、在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀使沉淀细胞松散均匀;置置40水浴中预热。水浴中预热。 d、用、用1ml吸管在吸管在1分钟左右（最佳时间为分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至秒）加预热至40的的50% PEG（PH 8.0）1ml,边加边轻轻搅拌。边加边轻轻搅拌。 e、用、用10ml吸管在吸管在90秒内加秒内加20-30ml预热至预热至37的不完全培养基的不完全培养基;20-37静置静置10分分 钟。钟。 f

12、、1000r/min 5分钟分钟;弃去上清。弃去上清。 g、加入、加入5ml HAT培养基培养基,轻轻吹吸沉淀细胞轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀使其悬浮并混匀,然后补加含腹腔巨噬然后补加含腹腔巨噬 细胞的细胞的HAT培养基至培养基至80-100ml。 h、分装、分装96孔细胞培养板孔细胞培养板,每孔每孔0.10-0.15ml;分装分装24孔板孔板,每孔每孔1.0-1.5ml;然后将培养然后将培养 板置板置37,6% CO2培养箱内培养。培养箱内培养。 i、5天后用天后用HAT培养基换出培养基换出1/2培养基。培养基。 j、7-10天后用天后用HT培养基换出培养基换出HAT培养基培养基;（第（

13、第14天后可用普通完全培养基）。天后可用普通完全培养基）。 l、经常观察杂交瘤细胞生长情况、经常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检以上时吸出上清供抗体检 测。测。 10102020天出现克隆天出现克隆 HATHAT筛选筛选杂交瘤细胞在融合后杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选周左右即可筛选,即即 把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来, 通常也称为抗体检测。通常也称为抗体检测。 融合细胞的早期培养融合细胞的早期培养 常用的抗体检测方法常用的抗体检测方法: （1）免疫酶技术）免疫酶技术 免疫酶技术是将

14、抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催 化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高,灵敏度高灵敏度高,现已广泛现已广泛 用于筛选和鉴定单抗。用于筛选和鉴定单抗。 用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA） 用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA 用全细胞抗原的用全细胞抗原的ELISA 抗体捕捉抗体捕捉ELISA试验试验 ABC-ELISA试验试验 Dot-ELISA试验试验 免疫组化染色法免疫组化染色法 （2）免疫荧光技术）免疫荧光技术 间接免疫荧

15、光法间接免疫荧光法 活细胞的膜荧光染色活细胞的膜荧光染色 （3）间接血凝试验）间接血凝试验 （4）放射免疫测定）放射免疫测定 HGPRTHGPRT酶与酶与TKTK酶酶: : 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶 （四）杂交瘤细胞的选择性培养（四）杂交瘤细胞的选择性培养 应用液应用液: : 8-8-氮氮杂杂鸟嘌呤鸟嘌呤 聚乙二醇聚乙二醇 HATHAT培养基培养基: : H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤 A（Aminopterin）:氨基喋呤氨基喋呤;叶酸拮抗物叶酸拮抗物,阻断阻断 DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine):

16、胸胸腺嘧啶核苷腺嘧啶核苷; ;“核苷酸前体核苷酸前体”, ,供供 细胞通过替代途径合成细胞通过替代途径合成DNADNA HATHAT选择作用选择作用: : 淋巴细胞淋巴细胞: :不能生长不能生长, ,5 57 7天死亡天死亡; ;DNADNA合成的主合成的主 要途径被要途径被A A阻断阻断 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞: :不能生长不能生长, ,5 57 7天死亡天死亡; ;HGPRTHGPRT缺缺 乏乏, ,DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻 SP2/O: HGPRT- ,TK-;长长命命 脾细胞脾细胞: HGPRT+ ,TK+ ;短命短命(7天天) 杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+

17、 ,TK+; 长长命命 骨髓瘤细胞、脾细胞与骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交杂交瘤细胞瘤细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞: : 长期生长繁殖长期生长繁殖 利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT,将将H合成为嘌呤合成为嘌呤 碱并最终与碱并最终与T一起合成一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力 有限稀释法有限稀释法(limiting dilution) FACS法法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar method) 二

18、、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 特点特点: : 不需任何特殊设备不需任何特殊设备 克隆出现效率高克隆出现效率高 实验室常用方法实验室常用方法 方法方法: : 细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞 有限稀释法有限稀释法 每种杂交瘤细胞分装每种杂交瘤细胞分装96孔板一块孔板一块,每个稀释度每个稀释度32孔孔,每孔量为每孔量为0.2ml, 每孔的杂交瘤细胞数分别为每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和和10。 效率最高效率最高 价格昂贵价格昂贵 FACS 软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar m

19、ethod) 37、7.5%湿润培养湿润培养7-14天天;克隆生长至克隆生长至2mm时时,用毛细吸用毛细吸 管吸出克隆管吸出克隆,直接转种于含有饲养细胞的直接转种于含有饲养细胞的24孔板孔板,扩大培养扩大培养 。 吸取上清吸取上清,检测抗体检测抗体,阳性孔可继续克隆化阳性孔可继续克隆化,或扩大培养、冻或扩大培养、冻 存。存。 配制方案配制方案: :杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml) + /ml) + 细胞冻存液细胞冻存液 (30%(30%40% 40% 牛血清牛血清, ,50%50%60% RPMI-164060% RPMI-1640培养液培养液, ,10%DM

20、SO )10%DMSO ) “慢冻慢冻”: :分步冷冻分步冷冻, ,30-7030-70液氮液氮保存数年至数十年保存数年至数十年 “快融快融”: :取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中水浴中, ,使其迅速融化、使其迅速融化、 复苏复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏 在建立杂交瘤细胞的过程中在建立杂交瘤细胞的过程中,有时一次融合产生很多有时一次融合产生很多“阳性阳性”孔孔, 来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作,需要把其中一部分细需要把其中一部分细 胞冻存起来胞冻存起来;另一方面另一方面,为了防止实验室可能发生的意外事故为了防止实

21、验室可能发生的意外事故 防止污染防止污染 避免染色体丢失避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义 （1）单克隆性的确定）单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和 单抗纯度鉴定等。单抗纯度鉴定等。 A A、杂交瘤细胞的染色体分析、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客 观指标之一观指标之一,

22、 ,杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总 和和, ,正常小鼠脾细胞的染色体数目为正常小鼠脾细胞的染色体数目为40, ,小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为为62-68, ,NS-1 为为54-56; ; B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 免疫扩散免疫扩散 ELISA C、单抗纯度的鉴定、单抗纯度的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳、等电点聚焦电泳 （IEF）及免疫）及免疫转印分析（转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。

23、）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、 SDS-PAGE、IEF、WB （三三）单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定 （2）单抗理化特性的鉴定）单抗理化特性的鉴定 抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度,其高低主要是由抗其高低主要是由抗 体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的 立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K ）表示。）表示。 常用的方法有竞争常用的方法有竞争ELISA、非竞争性、非

24、竞争性ELISA、间接、间接ELISA、 间接法夹心间接法夹心ELISA等等 （3）单抗与相应抗原的反应性测定）单抗与相应抗原的反应性测定 包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等 三、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩应立即扩 大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体 逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失, ,还应尽还应尽 早使

25、用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 （一）单克隆抗体的产生（一）单克隆抗体的产生 1 1 动物体内诱生方法动物体内诱生方法: : 每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠代小鼠, ,（5 51010）10105 5/ /只只, , 使用的动物当然首选使用的动物当然首选BALB/c小鼠小鼠,将杂交瘤细胞将杂交瘤细胞 接种于小鼠腹腔内接种于小鼠腹腔内,在小鼠腹腔内生长杂交瘤在小鼠腹腔内生长杂交瘤,并并 产生腹水产生腹水,因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度 很高。可见该法操作简便、经济很高。可见

26、该法操作简便、经济,不过不过,腹水中常腹水中常 混有小鼠的各种杂蛋白（包括混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig） 腹腔注射法腹腔注射法 2 2 体外培养法体外培养法: : a、悬浮培养法、悬浮培养法:小规模悬浮培养多采用转瓶培养小规模悬浮培养多采用转瓶培养,通过搅拌使通过搅拌使 细胞呈悬浮状态细胞呈悬浮状态;而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应 器器 b、微载体培养法、微载体培养法Microcarrier:主要以交联琼脂糖或葡聚糖、主要以交联琼脂糖或葡聚糖、 聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品 c、中空纤维细胞培养系统、中空纤维细胞培

27、养系统:由中空纤维生物反应器、培养基容由中空纤维生物反应器、培养基容 器、供氧器和蠕动泵等组成器、供氧器和蠕动泵等组成 d、微囊化细胞培养系统、微囊化细胞培养系统:先将杂交瘤细胞微囊化先将杂交瘤细胞微囊化,然后将此具然后将此具 有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养,一定时间后一定时间后,从培从培 养液中分离出微囊养液中分离出微囊,冲洗后打开囊膜冲洗后打开囊膜,离心后即可获得高浓度的离心后即可获得高浓度的 单抗。单抗。 （3）杂交瘤细胞的无血清培养）杂交瘤细胞的无血清培养 已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪已报道的各类无血清培养基有含有大豆类

28、脂的、含有酪 蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量 成分的无血清培养基成分的无血清培养基 利于单抗的纯化利于单抗的纯化,有助于大规模生产有助于大规模生产,可减少细胞污染的机可减少细胞污染的机 会会,且成本较低。且成本较低。 但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小,影响了单抗影响了单抗 的产量的产量; 可溶性抗原可溶性抗原: :ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原细胞、亚细胞结构上的抗原: :免疫荧光法（用免疫荧光法（用 丙酮和甲醇按丙酮和甲醇按1:11:1比例固定细胞

29、）比例固定细胞） （二）单克隆抗体的纯化（二）单克隆抗体的纯化 前前5 5天进行天进行, ,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane （1 15 5）10106 6细胞细胞 1 13 3w w形成腹水形成腹水 腹水型单抗的纯化腹水型单抗的纯化 高滴度腹水高滴度腹水 盐析沉淀盐析沉淀 亲和层析亲和层析 离子交换层析离子交换层析 McAb McAb的纯化的纯化 ELISAELISA 多头加样枪多头加样枪 ELISAELISA 。 免疫荧光法免疫荧光法 （四）单克隆抗体的特性（四）单克隆抗体的特性 高度特异性高度特异性 高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现

30、沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性对环境敏感性 优点优点 : : 在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代 用相对不纯的抗原用相对不纯的抗原, ,获得大量高度特异的、均一的抗体。获得大量高度特异的、均一的抗体。 适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 （五）单克隆抗体的优点与局限性（五）单克隆抗体的优点与局限性 局限性局限性 : : 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体反应强度不

31、如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高 McAb McAb PcPcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不纯可以不纯 纯度高纯度高 得量得量 高高 低低 特异性特异性 高高 低低 稳定稳定 低低 高高 沉淀反应沉淀反应 无无 有有 成本成本 高高 低低 McAbMcAb与与PcPcAbAb的比较的比较 基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody) 根据研究者的意图根据研究者的意图, ,采用基因工程方法采用基因工程方法, ,在基在基 因水平因水平, ,对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰

32、后导入受体细胞进行表达后导入受体细胞进行表达, ,产生新型抗体。主要包产生新型抗体。主要包 括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体 和双特异性抗体。和双特异性抗体。 将小鼠将小鼠IgIg基因敲除基因敲除, ,转染人转染人IgIg基因基因, ,在小在小 鼠体内产生人鼠体内产生人AbAb, ,再经杂交瘤技术再经杂交瘤技术, ,产生大量产生大量 完全人源化抗体完全人源化抗体 （一）人源化抗体（一）人源化抗体 方法方法: : 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因, ,与人与人IgIg恒定区恒定区 基因连接基因连接, ,插入适

33、当表达载体插入适当表达载体, ,转染宿主细胞转染宿主细胞, ,表达人表达人- -鼠嵌鼠嵌 合抗体合抗体 特点特点: : 减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力 1 1、嵌合抗体、嵌合抗体 嵌合抗体嵌合抗体 定义定义: :指利用基因工程技术指利用基因工程技术, ,将人抗体可变区（将人抗体可变区（V V）中互补决）中互补决 定簇（定簇（CDRCDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。重构成既具有序列。重构成既具有 鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和

34、力的人源化抗体。RAbRAb 亦叫亦叫“重构型抗体重构型抗体”, ,因其主要涉及因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”, ,又可称又可称 为为“CDRCDR移植抗体移植抗体 意义意义: :多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗 2 2、改型抗体、改型抗体 FabFab: :抗原结合片断抗原结合片断 FvFv: :可变区片段可变区片段 ScFvScFv: :单链可变区片段单链可变区片段 SdAbSdAb: :单区抗体单区抗体 （二）小分子抗体（二）小分子抗体 小分子抗体小分子抗体 其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合 （三）抗体融合蛋白（三）抗体融合蛋

35、白 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点, ,使抗原分使抗原分 子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤 抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体 连结在一起连结在一起, ,可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别, ,取取 得杀伤肿瘤细胞的作用。得杀伤肿瘤细胞的作用。 （四）双特异性抗体（四）双特异性抗体 分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb, ,使各抗体解离为单价使各抗体解离为单价 抗体抗体, ,再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂再使两种不