CRISPR procedure

1、CRISPR流程设计靶组分并使用CRISPR设计工具 1d1. 输入目标基因组DNA序列我们提供在线CRISPR设计工具() 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。2. 用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计。设计ssODN模板（任选） 1h3. 设计和订购定做的ssODN。购买直接来自IDT

2、或首选供应商的正义或反义ssODN的其中一个。我们推荐手动设计每侧至少40nt的同源臂，90nt可以得到最佳HDR效率。PAGE纯化ssODN不是必要的。4. 重新溶解和稀释ssODN ultramers到终浓度10uM。不要使正义和反义ssODNs结合或退火。储存在-20。准备sgRNA表达结构5. 为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或以质粒为基础的步骤（选项B）（A） 通过PCR扩增构建sgRNA表达结构 2h（i）准备稀释的U6 PCR模板。我们推荐使用pSpCas9（BB）或pSpCas9n（BB）（spl.2）作为PCR模板，但任何包含U6的质粒都可

3、以使用。用ddH2O稀释模板到10ng/ul。注意，如果一个质粒或cassette已经包含一个U6驱动的sgRNA作为模板，PCR之后就要进行一个凝胶回收（gel extraction）（step 5A iv），用QIAquick 胶回收试剂盒，来确保产物只含有目的sgRNA并且没有从模板来的任何sgRNA。（ii）准备稀释的PCR引物。ddH2O稀释U6-Fwd和U6-Rev（均用CRISPR设计工具或手动设计，对每个sgRNA是特异的。step1）引物（table1）到终浓度为10uM：加10ul 100uM引物母液到90ul ddH2O。（iii）U6-sgRNA PCR。以下反应for

4、每个U6-Rev引物：关键步骤：为了使扩增sgRNAs中的错误最小化，用高保真的聚合酶是很重要的。其他的高保真聚合酶，例如PfuUltra II（Aligent）或Kapa HiFi(Kapa Biosystems)，可以被用作替代。（iv）用以下循环条件做PCR（v）反应完成后，把一个样品产物跑胶来证明扩增成功：2%（wt/vol）琼脂糖胶，有SYBR Safe dye的TBE buffer 。5ul PCR产物用来跑胶，15V/cm 30min。反应成功的话应该有一个单独的370bp产物，模板应该看不见。？troubleshooting（vi）纯化PCR产物，用QIAquick PCR纯化

5、试剂盒。洗提DNA在35ul EB buffer（试剂盒中的）或H2O。Pause point：纯化的PCR产物可以在-20储存几个月（B）sgRNA cloning进入pSpCas9（BB）质粒，与Cas9共表达 3d（i）准备sgRNA oligos插入。重悬每个设计的sgRNA的顶部和底部strands（step1）到终浓度为100uM。准备以下体系使sgRNA oligos磷酸化和退火（顶部和底部组分strands）：（ii）使oligos在thermocycler 中磷酸化和退火，用以下参数：37 30min;95 5min;用5/min降至25。（iii）1:200稀释磷酸化的和退

6、火的oligos：加1ul oligo到199ul室温ddH2O。（iv）sgRNA oligos cloning到pSpCas9(BB)。每个sgRNA进行以下反应。我们推荐用一个未插入的，pSpCas9(BB)-作为一个阴性对照。注意：如果在之后的应用中用Cas9 D10A切口酶突变体，用pSpCas9n(BB)代替pSpCas9(BB)。或者，如果需要基于荧光的筛查或选择，用pSpCas9(BB)-2A-GFP, pSpCas9(BB)-2A-Puro, pSpCas9n(BB)-2A-GF或 pSpCas9n(BB)-2A-Puro代替。以下步骤使用pSpCas9(BB）为例：（v）孵

7、育ligation反应 共1h(iv)用PlasmidSafe核酸外切酶处理ligation反应，消化残留的线性DNA。这个步骤可选择但高度推荐。（vii）孵育PlasmidSafe反应：37 30min,70 30minPause point：此处理后，反应可以储存在-20至少1周（viii）转化。转化PlasmidSafe处理的质粒到感受态E.coli菌株，根据细胞提供的说明。我们推荐Stbl3菌株做快速转化。加2ul产物（step5B vii）到20ul冰上预冷化学处理的感受态Stbl3细胞，冰上孵育混合物10min，42热激30s，立即放回冰上2min。加100ul SOC培养基，涂到

8、含有100ug/ml ampi的LB平板。37孵育过夜。注意，当转化氨苄抗性质粒时，不必要在热激后为了生长期而孵育感受态细胞。（ix）Day 2：观察平板克隆生长情况。通常，阴性对照没有克隆（ligation of BbsI-digested pSpCas9(BB) alone without annealed sgRNA oligo insert），在pSpCas9(sgRNA) (sgRNA inserted into pSpCas9(BB)平板上有几十-几百个克隆。？troubleshooting（x）在每个平板上挑出2-3个克隆来检查sgRNA是否正确插入。用无菌枪头将单克隆挑至3ml

9、含100ug/ml ampi的LB培养基。37摇床孵育过夜。（xi）Day 3：从培养基中分离质粒DNA：QIAprep spin miniprep kit（xii）确定CRISPR质粒序列。通过用U6-Fwd引物测序U6启动子确认每个克隆的序列。可选：用Cbh-Fwd和SXRP002-007引物（spl.data 1）测序Cas9基因。参考pSpCas9(BB) cloning vector 序列的测序结果来核对20nt引导序列被插入在U6启动子和remainder of the sgRNA scaffold 之间（fig 4c）。细节和pSpCas9(BB)在GenBank的序列图谱可以在

10、/找到。？troubleshootingsgRNA功能确认：HEK 293FT细胞培养和转染 3-4d关键：CRISPR-Cas系统已经在许多哺乳动物细胞系中应用。每个细胞系条件可能不同。下面我们详述了HEK 293FT细胞的转染条件。注意，ssODN介导的HDR转染，用Amaxa SF细胞系Nucleofector kit，在step14-29说明。hESC(HUES9)培养和转染，step30-53。6. HEK 293FT细胞培养。根据厂商推荐。D10培养基，补充10%（vol/vol）FBS，37，5% CO2。7.

11、 接着，弃掉培养基，从容器一端轻轻加入DPBS漂洗一次，不要使细胞移动。加2ml TrypLE到T75 flask，37 5min孵育体系。加10ml热的D10培养基终止胰酶反应，转移细胞到50ml Falcon管。轻轻上下吹打使细胞分离，再将细胞种在新的培养瓶。关键步骤：我们通常2-3d分细胞，分流比1:4或1:8，不要让细胞多于70%。Cells are discarded upon reaching passage number 15（传到15代时丢掉细胞？）8. 准备转染细胞。转染前，将细胞很好的分离到24孔板，用无抗生素D10培养基培养16-24h。细胞密度在1.3105每孔，总体积

12、500ul。根据细胞提供者的指南按比例增加或减少。关键步骤：不要用多于推荐密度的细胞，可能会减少转染效率。9. 转染当天，细胞最好在70-90%。可以用lipo2000或Amaxa SF cell line 4D-Nucleofector X kit（根据manufacturers instructions ）。按以下方法转染：sgRNAs cloned into pSpCas9(BB), 转染500ng sequence-verified CRISPR plasmid (pSpCas9(sgRNA)。如果转染超过一种质粒（Box2）,按照equimolar比例混合，并使用不超过500ng总D

13、NA。PCR扩增的sgRNA，混合下列：关键步骤：我们推荐转染三个平行以得到可靠的数据，包括转染对照（如GFP质粒）来保证转染效率。如果做荧光挑选或药物筛选，pSpCas9(sgRNA)-2A-GFP或 pSpCas9(sgRNA)-2A-Puro 可以用来代替 pSpCas9。此外，pSpCas9(BB) cloning plasmid and/or the sgRNA amplicon 单独转染作为阴性对照，为了下面的功能实验。10. 轻轻加lipofectamine complex到细胞中，因为HEK293FT很容易脱落，可能会导致转染效率低。11. 24h后观察细胞转染效率。转染对照（

14、如GFP）中的荧光细胞百分数可以用荧光显微镜看到。通常会有多于70%的细胞转染了。？troubleshooting12. 补充额外的50ul热的D10培养基到培养基中。关键步骤：从孔的一边非常缓慢的加D10，不要用冷的培养基，可能会使细胞脱落。对HEK 293FT细胞，嘌呤霉素选择的浓度可以在1-3ug/ml（可能根据细胞系而有所不同）。13. 转染后孵育细胞48-72h，之后传代并做downstream applications or harvesting for indel analysis。共转染CRISPR质粒和HDR模板到HEK 293FT细胞（可选） 3-4d14. 使1-2ug靶

15、vector线性化:在一个同源臂旁边或任何一个同源臂的远端vector backbone的限制性位点切割。或者，如果使用ssODNs，只要重新溶解他们到终浓度为10uM（step4）并且跳过step15,1615. 在0.8-1%（wt/vol）琼脂糖胶上跑小量的线性质粒和未切割质粒，确定线性化成功。线性化的质粒应该跑在超螺旋质粒上面（run above）16. 纯化线性质粒：QIAQuick PCR Purification kit, elute in 35 l of EB buffer17. 准备转染的细胞。在T75或T225 flasks中培养HEK 293FT。在转染时要有足够的细胞（

16、2105细胞每个转染，如果用Amaxa SF cell line 4D-Nucleofector X kit S）18. 预热平板做转染。加1ml热的D10培养基到12孔板的每个孔，将平板放在培养箱中保持培养基热的。19. 用下面表格中选项A来准备共转染HDR靶质粒和Cas9质粒或选项B来共转染ssODN与Cas9质粒。转染对照，step9。如果一个sgRNA被cloned into pSpCas9(BB)-2A-GFP，细胞也可以被荧光挑选出来。如果用Cas9切口酶介导HDR，pSpCas9(sgRNA) 用 pSpCas9n(sgRNA)代替Step 5B(v)。关键步骤：HDR的应用，我

17、们推荐cloning sgRNA guides into one of the sgRNA expression plasmids （step 5B），而不是用以PCR为基础的表达方法。20.分离细胞做转染。弃掉培养基，用DPBS轻轻地漂洗细胞一次，注意不要洗脱细胞。加2ml TrypLE到T75 flask，37孵育5min，加入10ml热的D10培养基，在50ml falcon管中磨碎。关键步骤：确保轻轻的磨碎细胞，分离出单个细胞。大块细胞会降低转染效率。21. 细胞悬浮液中分装10ul，稀释到90ul D10培养基中培养。计数细胞，计算需要转染的悬液体积。我们通常转染2105细胞每个co

18、ndition，用Amaxa SF cell line 4D-Nucleofector X kit S, 并且我们推荐多算20%的细胞来平衡后面的损失。将需要的体积转移到新的Falcon管（20ul每个转染加上浪费的体积）22. 上一步中的细胞 200g 5min 室温 spin down23. 准备转染溶液：混合SF solution和S1 supplement（Amaxa SF cell line 4D-Nucleofector X kit S中提供），每个转染要用总共20ul补充的SF solution。同样的，我们建议计算比需要体积多20%的量。24. Step22中的细胞沉淀中，完全

19、弃掉培养基，恰当的体积轻轻重悬细胞（20ul每2105个细胞），用S1-supplemented SF solution 。不要在SF solution中留下细胞for extended periods of time.25. 从step19中吸取20ul重悬细胞到每个DNA premix。轻轻吹打混匀，转移到一个Nucleocuvette strip chamber。重复这个步骤for each transfection condition。26. 用 Nucleofector 4D program recommended by Amaxa, CM-130 electroporate细胞27

20、. 轻轻和缓慢的吸取100ul热的D10培养基到每个Nucleocuvette strip chamber，把全部体系转到一个有预热培养基的孔（from step18）关键步骤：细胞在这个阶段很脆弱，动作不轻会导致细胞死亡28. 孵育混合物24h。此时，从阳性转染对照的荧光细胞百分数可以估算转染效率。Nucleofection通常有70-80%的转染效率。？troubleshooting29. 缓慢加入1ml热的D10培养基到每个孔，不要弄下细胞。HEK 293FT细胞嘌呤霉素选择可以用1-3ug/ml的浓度（可能根据细胞系不同有变化）。用嘌呤霉素孵育细胞至少72h。下面的实验或者基因分型中，

21、细胞可以在常规培养基中培养。hESC(HUES9)培养和转染 3-4d关键：hESCs和人类产生的多能性干细胞转染效率，单细胞分离的tolerance和培养环境可能差别很大。需要根据你的细胞系进行选择30. 培养HUES9细胞。我们通常培养HUES9细胞（一个hESC细胞系）是在feeder-free环境中用mTesR1 培养基。准备mTesR1 培养基：加5supplement，包括基础培养基和100ug/ml Normocin。31. 准备一个10ml分装mTesR1 培养基，补充10uM ROCK抑制剂32. Coating一个组织培养盘。稀释冷的GelTrex到冷的DMEM 1:100

22、，coat the entire surface of a 100-mm tissue culture plate.33. 将培养皿放在培养箱中，至少37 30min34. 37融化一小瓶细胞，转移细胞到一个15ml falcon管，加5ml mTesR1 培养基，200g 5min RT 沉淀35. Aspirate the GelTrex coating (Step 32) ，接种1106细胞，10ml mTesR1 培养基（含ROCK抑制剂 step31）36. 24h后用不含ROCK抑制剂的mTesR1 培养基培养，每天换液37. Passaging cells. 在达到70%之前分细

23、胞38. 弃掉mTesR1 培养基并用DPBS洗一次细胞39. 加2ml Accutase使细胞分离，37孵育3-5min40. 加10ml mTesR1 培养基使细胞分离，转移混合物到一个15ml Falcon管并轻轻重悬。41. 重新把细胞铺板在GelTrex-coated plates，mTeSR1 medium with 10 M ROCK inhibitor42. 铺板后24h换成正常的mTeSR1 medium 43. 转染。我们建议解冻融化后，Amaxa P3 primary cell 4D Nucleofector kit转染之前，培养细胞至少一周。44. 转染之前，对数生长期

24、的细胞（50-70%）用新鲜培养基重新培养2h。45. 用Accutase轻微重悬使细胞分离成单个或小细胞团（不超过10个细胞，显微镜观察）46. 计算出nucleofection所需的细胞数（每个转染200,000个细胞），200g,5min RT spin down47. 完全弃掉培养基，用20ul S1-supplemented P3 nucleofection solution重悬，每2105细胞。48. 吸取重悬的细胞和加入的DNA（step9,19），加入electroporation cuvettes，根据建议的程序电穿孔。2 105 细胞, 我们一般用1g of total D

25、NA49. 轻轻地把电穿孔的细胞铺板在coated 100-mm plates（补充10 M ROCK inhibitor）50. 确认转染是否成功（step11,28），nucleofection后24h，每天用常规的mTeSR1培养基换液。嘌呤霉素选泽可以用0.5ug/ml浓度（可能不同细胞系不同）。通常用Amaxa nucleofection会有大于70%转染效率。？troubleshooting51. 转染后48-72h，用Accutase分离细胞，轻轻重悬在5ml mTeSR1。保留此阶段的一部分重悬细胞做重新铺板（step41,42确保每一次passaging都加了ROCK抑制剂）

26、，for下面应用或clonal分离（step54-70），用余下的细胞做基因分型（step71-126）关键步骤：不要不用Accutase而物理的分离细胞52.200g 5min RT沉淀下细胞关键步骤：spin细胞之前要先让Accutase失去作用，速度不要超过建议，否则可能造成细胞溶解。53. QuickExtract solution处理沉淀细胞直接抽提DNA（step71-74）Isolation of clonal cell lines by FACS ：23 h hands-on; 23 weeks expansion关键：从转染细胞（step51）中Isolation clona

27、l cell populations可以在转染后24h用FACS（step54-65）或序列稀释（step66-70）做。不同类型的细胞在对FACS的应答，clonal-密度稀释或其他分离步骤可能不同，需要看特定文献。54. 准备FACS media。细胞可以在常规的D10培养基（补充青霉素和链霉素）中被分选。含有抗生素的培养基需要用0.22uM 无菌过滤器过滤。如果可以荧光分选，没有酚红DMEM或DPBS可以用来代替正常DMEM。55. 96孔板，加100ulD10培养基（每孔补加s.p.）关键步骤：不是所有的分选细胞都能活过FACS过程或随后的生长期，因此，准备的板数和分选出的细胞需要调整

28、来确保得到足够数量的细胞系。56. 准备细胞for FACS。完全吸出培养基，加足够的TrypLE来分离细胞（from step11或28），薄薄的覆盖转染细胞的贴壁层。37孵育混合物5min，加400ul热的D10培养基。57. 转移重悬的细胞到15ml Falcon管并轻轻粉碎triturate？20次关键：显微镜下确认分离成了单个细胞。58.200g 5min RT spin down细胞59. 弃掉培养液，重悬在200ul FACS培养基中60. 过滤细胞到细胞strainer管通过他的mesh cap。将细胞放在冰上直到分选。61. 将单个细胞分选到96孔板（step55准备的）。如

29、果sgRNA is cloned into pSpCas9(BB)-2A-GFP，可应用荧光来做转染细胞。分选之后，显微镜下检查培养板并且确保板中大部分孔都有一个细胞。？troubleshooting62. 将细胞重新放到培养箱中，使他们扩增2-3周。分选之后5d加100ul热的D10培养基。每3-5天换100ul培养基。63. 分选后一周，检查colonies的“clonal” appearance ：从中心点发出的圆形克隆。划分出空的孔或可能接了多于一个细胞的孔。64. 当细胞多于60%，准备平行平板传代（每个克隆一个孔），在平行平板每个孔中加100ul D10培养基。剧烈吹打20次使细胞

30、分离，平行铺板20%重悬体积使细胞传下去。每2-3天换液。65. 余下的80%细胞：DNA isolation和基因分型（step71-74）Isolation of clonal cell lines by dilution 23 h hands-on; 23 weeks expansion关键：细胞类型不同，对FACS的反应，clonal-浓度稀释或其他分离步骤也不同，参考具体文献。66. 转染后48h从转染孔中分离细胞（step11或28）。确保分离成单个细胞。可以用细胞滤网过滤细胞防止聚集成团。67. 计数每个24孔板中的细胞数，用D10培养基连续稀释到终浓度为每100ul 0.5个细

31、胞来减少每孔含有多个细胞的可能性。我们推荐每个96孔板用60个细胞在12ml D10培养基中，每个转染的细胞种至少铺板2个96孔板。关键：单细胞分离和精确计数细胞是clonal稀释中很关键的。我们建议在显微镜下检查分离细胞，并且在系列稀释的中间段重新计数细胞来确保精确性。？troubleshooting68. 吸取100ul稀释的细胞到96孔板的每个孔。余下的细胞悬液可以保留用来做种群水平的基因分型来估算总体的变异效率。69. 铺板后1周检查克隆的clonal表型（从中心点发出的圆形克隆）。划出可能接种了多细胞的孔。70. 细胞重新放回培养箱并培养2-3周。根据需要换液和平行铺板，详述在ste

32、p64,65.功能测试：detection of indel mutations by the SURVEYOR nuclease assay 5-6h关键：在实验转染细胞的分割效率之前，我们建议在阴性对照（未转染）样品测试每个新的SURVEYOR引物for SURVEYOR核酸酶分解的预期的细胞类型。71. 收细胞做DNA提取。分离所有的转染细胞（from step13,29,53,65,70），200g 5min RT spin down。使用平行板维持转染细胞系的培养。72. 完全吸掉培养基73. DNA抽提，用QuickExtract solution。我们通常用溶液中的50ul或10

33、ul for24-96-孔板的每个孔。74. 用ddH2O将提取的DNA标准化到终浓度为100-200ng/ulPause point:提取的DNA可以在-20保存几个月75. SURVEYOR PCR。混匀下列，使用CRISPR设计工具提供的SURVEYOR引物（step1）关键：SURVEYOR实验依靠检测单碱基错配。因此很重要的是用高保真聚合酶。其他的高保真聚合酶，如PfuUltra (Agilent) or Kapa HiFi (Kapa Biosystems) ，可以用作替代。此外，因为SURVEYOR切割结果可以检查自然发生的单核苷酸多态性，很重要的是做阴性对照样品（未转染或未修改

34、的细胞）。76. PCR，循环条件如下，不超过30个扩增循环。77.2-5ul PCR产物跑胶 1%琼脂糖胶，检查single-band产物。虽然这些PCR条件是设计来与大部分SURVEYOR引物一起做的，一些引物可能需要额外优化，通过调整模板浓度，MgCl2浓度和/或退火温度。？troubleshooting78. 纯化PCRs用QIAQuick PCR purification kit, 标准化洗脱产物到 20 ng/l Pause point:纯化的PCR产物可以在-20储存几个月79. DNA异源双链核酸分子的形成。退火反应如下：80.退火反应，条件如下：81.SURVEYOR核酸酶S

35、 digestion。冰上，master-mix并加入以下组分到退货的异源双链核酸分子（from step 80），终体积25ul关键：注意SURVEYOR nuclease digestion (included in the SURVEYOR mutation detection kit) 中用的 MgCl2是更高浓度的（比SURVEYOR PCR中用的）82. 充分涡旋混合物，短暂离心，42孵育反应30min83. （可选）加2ul SURVEYOR kit中的Stop solution，如果不想立即看到反应产物（下一步）Pause point：stop solution消化的产物可以储

36、存在-20至少2d84. 观察SURVEYOR反应。SURVEYOR核酸酶消化产物可以在2%琼脂糖胶上看到。为了更好的分辨率，可以在4-20%梯度聚丙烯酰胺TBE凝胶上跑。通常，我们一直跑到溴酚蓝迁移到胶的底部。同一个胶上包括DNA ladder和阴性（未转染）对照85. 染胶，用SYBR Gold dye 1:10,000稀释TBE（20ul储备液到200mlTBE），轻轻晃胶15min。注意避光。86. 定量观察胶，不要过度曝光。阴性对照应该只有一条与PCR产物大小相符合的带，但有时也会有非特异的其他大小的切割条带。如果与目的条带有明显的大小差异就不会干扰结果。CRISPR Design

37、Tool提供的目标切割条带大小之和，应该等于PCR产物的大小。87. 估计分裂程度。测PCR扩增子和分裂的条带的整体强度，用ImageLab，ImageJ，或其他胶定量软件。88. 每条泳道中，用下面公式计算分裂的PCR产物分数：fcut = (b + c)/(a + b + c), a是integrated intensity of the undigested PCR product，b和c 是integrated intensities of each cleavage product（A sample gel is shown in Figure 6.）89. 可以用以下公式估算ind

38、el occurrence，二项概率分布功能测试：PCR检测基因组microdeletions 34 h hands-on; 23 weeks expansion90. 转染细胞（如step8-13或43-51），用一对敲除区域侧面的sgRNAs91. 转染后24h，用FACS分离单个细胞，或通过系列稀释（如step54-70）92. 细胞扩大培养2-3周93. 从clonal lines中提取DNA（如step71-74），用10ulQuickExtract solution，用ddH2O标准化基因组DNA到终浓度为100ng/ul94. PCR扩增和分析修饰区域。选项A：分析microde

39、letions；选项B：分析染色体倒置inversions（A） 敲除或micro敲除分析（i）分析micro敲除，用Out-Fwd和Out-Rev引物，两者都被用来使敲除区域外部退火，用产物大小分析来证实成功敲除。如果敲除大小大于1kb，做一个平行PCR，用In-Fwd和In-Rev引物来筛查WT等位基因的出现。（fig 5C）与SURVEYOR一样，包括一个阴性（未转染样品）对照。PCR做法如下：（B）Inversion分析（i）用以下PCR方法筛查染色体倒置（fig 5c）。注意引物配对可能是Out-Fwd + In-Fwd 或Out-Rev + In-Rev 。包括一个阴性对照。95.

40、用以下循环条件做PCR96.1-2%琼脂糖胶跑2-5ulPCR产物，确定敲除的产物大小，或者倒置时PCR产物的有无。虽然这些PCR条件适用于大多数引物，一些引物可能需要通过调整模板浓度，MgCl2浓度和或退火温度来额外的优化。？troubleshooting功能测试：HDR介导的目标修饰的基因分型，用RFLP分析 3-4h97. 提取DNA（step71-74），用QuickExtract solution，标准化基因组DNA到终浓度100-200ng/ul98. PCR扩增修饰的区域。HDR-Fwd和HDR-Rev引物被用来在ssODN和靶基因组区域之间的同源区域之外退火。包括一个阴性（未转

41、染）对照样品。PCR条件如下：99.进行以下程序100.0.8-1%琼脂糖胶跑5ulPCR产物，检查单一条带产物。引物可能需要其他优化，通过调整模板浓度，Mgcl2浓度和或退火温度？troubleshooting101. 用QIAQuick PCR purification kit纯化PCRs102. 在fig6提供的HDR例子中，hindIII限制性位点被查入了EMX1基因。这些通过RFLP分析PCR扩增子检测103.消化DNA ,37 10min 104. 跑10ul消化产物和loading染料，4-20%梯度聚丙烯酰胺TBE胶，指导二甲苯胺条带迁移到胶的底部。105. 用SYBR Gol

42、d染料染胶，边摇晃15min。注意避光106. 如上述拍摄和定量分裂产物for SURVEYOR实验部分（step86-89）107. 用下面公式估算HDR效率：（b+c）/(a+b+c)，a 是integrated intensity for the undigested HDR PCR product, b 和c are the integrated intensities for the HindIII-cut fragments108. 或者，clone step101中基因型纯化的PCR扩增子，通过Sanger测序（step109-117）或deep测序（step118-126）As

43、sessment of Cas9 cleavage or HDR-mediated target modification efficiency by Sanger sequencing 3d关键：不同于SURVEYOR或RFLP实验，来自于转染细胞（step8-13,14-28,HEK 293FT；43-51，HUES9细胞）靶区域的基因组扩增子（产生于step78或101）可以被clone进入质粒，并且可以准备一套clones做Sanger测序来估计Cas9切割或HDR介导的靶修饰效率。SURVEYOR或HDR引物可以被用作Sanger测序，如果在Fwd和Rev引物上添加合适的限制性位点。

44、For cloning into the recommended pUC19 backbone, EcoRI can be used for the Fwd primer，HindIII for the Rev primer109. 目标位点扩增子消化。消化反应如下：110.pUC19 backbone digestion.进行如下消化反应并在37 C 孵育15 min111.用QIAQuick PCR purification kit纯化消化反应Pause point：纯化的PCR产物可在-20过夜112. Ligate the digested pUC19 backbone and PCR product at a 1:3 vector:insert ratio 室温孵育15 min.一定要包含一个vector-only ligation control.113.用PlasmidSafe核酸外切酶处理连接反应，消化残余的线性DNA。这个步骤推荐但不必须。114.细菌转化。将PlasmidSafe-treated plasmid 转化入competent E. coli strain ，根据细胞的说明说。我们推荐Stbl