表面增强拉曼光谱分析原理及应用

1、2021/3/10讲解：XX1 表面增强拉曼光谱 分析原理及应用 2021/3/10讲解：XX2 一、引言 二、拉曼光谱基本理论 三、拉曼光谱仪器介绍 四、表面增强拉曼光谱概述 五、表面增强拉曼光谱的应用 六、前景展望 2021/3/10讲解：XX3 一、引言 用单色光照射透明介质（气体、液体或固 体）时，绝大部分的光沿着入射光的方向 透过，在透射和反射方向以外会出现光的 散射现象。 当激发光的光子与作为散射中心的光子相 互作用时，大部分光子只是改变方向发生 散射，而光的频率与激发光的频率相同， 这种散射称为Rayleigh散射。 约占光散射强度的10-610-9的散射，不仅改 变光的传播方向

2、，而且散射光的频率不同 于激发光的频率，这种散射称为Raman散射 。 2021/3/10讲解：XX4 光散射的过程：激光入射到样品，产生散射光。 散射光 弹性散射（频率不改变-瑞利散射） 非弹性散射（频率改变-拉曼散射） 2021/3/10讲解：XX5 2021/3/10讲解：XX6 2、拉曼光谱基本理论 2.1 拉曼光谱历史渊源 1923年德国的Smeka理论上预言了光的非弹 性散射 。 1926年印度物理学家Raman在论文中开始并 没有肯定这种散射是非弹性的,以后的许多 次实验最终证明了这种散射的非弹性,他将 这种效应称为“一种新辐射”。 1928年,Raman和Kishnan首先在液

3、体苯中观 察到了这种散射效应。此后不久,俄国物理 学家Lardsberg和MandelStam在石英中也发 现了同样的光散射现象,他们称之为“联合 散射光谱”。 2021/3/10讲解：XX7 1928年，Cabanues和Rocard在巴黎也证实了 Raman的观察结果,Pringsheim撰文总结并指 出Raman发现的是一种全新的现象,并建议 称之为Raman效应, 1930年42岁的Raman为此获得了诺贝尔物理 学奖,这是亚洲人获得的第一个诺贝尔科学 奖。 2021/3/10讲解：XX8 2.2拉曼光谱基本原理 拉曼光谱是单色光束入射光的光子与 分子发生非弹性散射的结果。在非弹 性碰

4、撞过程中，光子与分子之间发生 能量交换，光子不仅改变运动方向， 同时光子的一部分能量传递给分子， 或分子的振动和转动能量传递给光子 ，从而改变了光子的频率，这种散射 过程称为拉曼散射。 2021/3/10讲解：XX9 2.3拉曼光谱量子理论 瑞利散射： 弹性碰撞， 无能量交换， 仅改变方向。 拉曼散射： 非弹性碰撞； 方向改变， 且有能量交换。 2021/3/10讲解：XX10 拉曼散射的两种能量差 2021/3/10讲解：XX11 A、E=h(v0 v） 产生stokes线：强；基态分子多 B、E=h(v0 v) 产生反stokes线：弱 Stokes与反Stokes线的频率与入射光频率之差

5、v 称为Raman位移。同一种物质分子，随着入 射光频率的改变，Raman线的频率也改变， 但位移v始终保持不变，故Raman位移与 入射光频率无关。 2021/3/10讲解：XX12 RayleighStokes Anti- Stokes Resonance Raman Fluorescence 2021/3/10讲解：XX13 拉曼光谱研究分子振动和转动模式的机 理与红外光谱的异同点？ 相同点：同属于分子光谱。两者都是研究分子振 动的重要手段。 不同点：一些同核原子对称结构的官能团(如：- C=C-、-N=N-、-S-S-等)在红外光谱仪较难检测的 信息，在拉曼光谱仪上却有较强的反映；而在

6、红外 光谱中有很强吸收峰的不均衡对称的官能团，在拉 曼光谱却表现很弱。 2021/3/10讲解：XX14 3、拉曼光谱仪器 激光Raman光谱仪 激光光源： A、He-Ne激光器， 波长632.8nm B、Ar激光器 波长514.5nm 488.0nm 2021/3/10讲解：XX15 傅里叶变换-Raman光谱仪 光源：Nd-YAG钇铝石 榴石激光器 （=1064nm） 2021/3/10讲解：XX16 3.1 仪器结构 1、激光光源 根据所用的材料不同大致可把激光器分为气 体激光器、固体激光器、半导体激光器和燃料激 光器等四大类。气体激光器的类型最多，在拉曼 光谱仪中的应用也最广泛。它包括

7、原子气体激光 器、离子气体激光器、分子气体激光器以及准分 子激光器。固体激光器主要有红宝石激光器、掺 钕的钇铝石榴石（YAG）激光器、掺钕的玻璃激 光器等。这类激光器的特点是输出功率高，并且 体积小又很坚固。其YAG激光器是一种比较有用 的固体激光器，其激光波长为1064nm。半导体激 光器在所有的激光器中是效率最高、体积最小的 一种激光器。 2021/3/10讲解：XX17 2、外光路系统 外光路系统一般是指在激光器之后、单色器 之前的光学系统，它的作用是为了有效地收集拉 曼散射光。在外光路系统中，激光器输出的激光 首先经过光栅，以消除激光中可能混有的其它波 长的激光以及气体放电的谱线（若激

8、光无杂线时 ，可不用此光栅）。纯化后的激光经棱镜折光改 变光路再由透镜准确地聚焦在样品上。样品所发 出的拉曼散射光再经聚光透镜准确地聚集在单色 仪的入射狭缝上。 2021/3/10讲解：XX18 3、样品池 由于在可见光区域内，拉曼散射不会被 玻璃吸收，因此拉曼光谱的一大优点是样 品可放在玻璃制成的各种样品池中，这给 样品的拉曼测试带来很大便利。样品池可 以根据实验要求和样品的形状和数量而设 计成不同的形状。 2021/3/10讲解：XX19 4、单色器 经样品散射的光，其绝大部分为Rayleigh散射 光，Raman散射光强度仅为Rayleigh散射光强度的 10-610-9，散射光由外光路

9、系统收集进入单色仪 。单色仪是色散型拉曼光谱仪的心脏部分，它应具 有杂散光少、色散度高等特点。为了降低Rayleigh 散射光对检测强度较弱的拉曼散射光的影响，通常 采用双单色仪，有时甚至采用三单色仪来进一步降 低杂散光，提高分辨率。但光栅的反射率一般小 100%，使用多光栅必然要降低光通。 2021/3/10讲解：XX20 5、检测和记录系统 激光拉曼光谱仪中一般采用光电倍增管做探 测器，由于拉曼散射强度很弱，这就要求光电倍 增管要有高的量子效率和尽可能低的热离子暗电 流。近年来，液氮冷却的CCD型电子偶合器件探 测器的使用可大大提高探测器的灵敏度。由探测 器输出的信号必须经放大，然后由记录

10、仪记录或 输出到计算机上。 2021/3/10讲解：XX21 3.2拉曼光谱技术优越性 1、水的拉曼散射强度很微弱,因此拉曼光谱是研究水 溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。 2、拉曼一次可以同时覆盖很广波数的区间,可对有机 物及无机物等多种物质进行分析。相反,若让红外光 谱覆盖如此广阔的区域则必须改变各种器件的参数, 相比较而言程序复杂不具有通用性。 3、拉曼光谱的谱峰清晰尖锐,适合定量研究以及运用 差异分析进行定性研究。在化学结构分析中,独立的 拉曼区间的强度和功能集团的数量相关。 2021/3/10讲解：XX22 4、由于激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2- 2毫米,所以,常规

11、拉曼光谱只需要少量的样品就可 以得到。而且,拉曼显微镜物镜可以将激光束进一 步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小体积的 样品。 5、利用共振拉曼效应,可以用来有选择性地增强大 生物分子特个发色基团的振动,这些发色基团的拉 曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。 2021/3/10讲解：XX23 4、表面增强拉曼光谱概述 4.1 SERS的发现 表面增强拉曼散射现象第一次被观测到,是在 1979年,Fleischman小组在对粗糙化的Ag电极表面 的吡啶进行研究时,发现其具有巨大的拉曼散射现 象4。后来直到VanDuyne和Creighion领导的两个 研究小组5,6分别重复了这个实

12、验并证实了这一现 象。通过计算,这种银电极表面的吡啶分子的拉曼 信号是其水溶液的106倍。这一崭新的现象被称之 为表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)。 2021/3/10讲解：XX24 4.2 SERS基本原理 SERS效应可以使拉曼信号得到高达几 个数量级的增强,通常是增强来自分子的信 号。SERS中信号的增强主要来自于光与金 属之间的电磁作用。这种作用会通过等离 子体共振激发使得激光场得到极大的增强 。要产生这一现象,分子必须吸附在或者非 常接近金属表面(通常最大约为10nm)。 SERS的命名,能很好的总结这一效应的要点: 2

13、021/3/10讲解：XX25 Surface(S): SERS是一种表面光谱技术,因此分子必须吸附在(或 者很接近)金属表面。这是对SERS的应用来说最主要 的一点。必须确保要检测的分子“贴” 到了金属基 底的表面。 Enhanced(E): 信号高达104-107的增强是由金属基底上的等离子体 共振造成的。事实上,等离子体共振是与金属的电磁 辐射作用有关的一系列效应的简称。另外，SERS效 应中,金属以纳米结构的形式出现,从金属溶胶到用纳 米光刻制或者自组装制备,形式变化多样。不同的金 属,要求的粗糙度也不一样。在可见光范围内，Ag的 粗糙度在100nm左右,有较好的增强效果8。而Cu的

14、粗糙度在50nm，在红外区增强最明显9。 2021/3/10讲解：XX26 Raman(R): 这项技术存在于分子(SERS探针或被分析物)信号 的测量。拉曼光谱研究的是非弹性散射,能解析被 探测分子的化学结构尤其是振动结构。 S: 表示scattering或者spectroscopy，当强调光学效应 时,用scattering；当强调光谱技术及其应用时,用 spectroscopy。 2021/3/10讲解：XX27 4.3 SERS机理 为了解释 SERS 的增强机制，人们提出了不 同的理论模型。由于分子的拉曼散射是分子在外 电场作用下被极化而产生极化率，交变的极化率 在再发射的过程中，受

15、到分子中原子间振动的影 响，从而产生拉曼散射光。散射光的增强可能是 由于作用在分子上的局域电场的增加和分子极化 率的改变，可以形象地把分子的极化偶极矩看成 是电磁效应和分子效应的乘积。目前学术界普遍 认同的 SERS 机理主要有物理增强机理和化学增 强机理两类, 物理增强机制通过局域场和偶极发射 起作用，化学增强机制通过分子的极化率起作用 。 2021/3/10讲解：XX28 4.3.1物理增加机理 物理类模型致力于阐释金属表面局域电场的 增强，它认为，具有一定表面粗糙度的类自由电 子金属基底的存在，使得入射光在表面产生的电 磁场得到较大的增强，而拉曼散射强度与分子诱 导偶极矩 P 的平方成正

16、比，因此极大地增加了吸 附在表面的分子产生拉曼散射的几率，从而提高 了检测到的表面拉曼强度。物理类模型主要包括 以下几种典型模型。 2021/3/10讲解：XX29 A、表面电磁场模型 表面电磁增强模型又可称为表面等离 子体共振模型。该模型认为，在光电场作 用下，金属表面附近的电子会产生疏密振 动。因此当粗糙化的衬底材料表面受到光 照射时，衬底材料表面的等离子体能被激 发到高的能级，而与光波的电场耦合，并 发生共振，使金属表面的电场增强，从而 产生增强的拉曼散射。 2021/3/10讲解：XX30 B、天线共振子模型 天线共振子模型是 P.Watcher 教授10在1983年提 出的 SERS

17、 增强机制理论模型。该模型认为具有 一定粗糙度的金属表面的颗粒或凸起可看作是有 一定形状，能与光波耦合的天线振子。粗糙金属 表面的突出物或各种微粒可以被看作位于电磁场 中的天线振子，它们既可以吸收电磁波，也可以 发射电磁波。当电磁波波长和粒子尺寸之间满足 一定条件时，电磁波在粒子中将发生共振，此时 辐射场最大；同时，吸附在粒子表面上分子的拉 曼散射光(也是一种电磁辐射)强度也会受到天线振 子的增强，从而产生 SERS 效应11。 2021/3/10讲解：XX31 C、表面镜像场模型 表面镜象场模型是提出得比较早的电磁 增强类模型之一，镜像场模型假定金属表 面是一面理想的镜子，吸附分子为振动偶

18、极子，它在金属内产生共轭的电偶极子， 以此在表面形成镜像光电场。入射光与镜 像光电场都对吸附分子的表面拉曼信号起 增强作用，再加上表面反射造成两倍的局 域电场增强，可以得到总增强效应。 2021/3/10讲解：XX32 D、避雷针效应 金属粗糙过程中产生的表面粒子形状各不相 同，一些粒子或粒子的某些部位曲率半径非常小 ，这些颗粒的尖端处具有很强的局部表面电磁场 。曲率半径越小，其表面电场强度越大，从而引 起拉曼散射强度的增强。 2021/3/10讲解：XX33 4.3.2 化学增强机理 A、电荷转移模型 电荷转移模型认为13：在适当波长的激光照 射下，金属中的电子被激发到电荷转移态上去， 这会

19、引起分子原子核的骨架松弛，因为分子在基 态和激发态下的平衡位置不同。当电子再回到金 属中时发射的光子能量就比入射光少了一个振动 量子的能量。增强的原因是散射过程同电荷转移 态共振。 2021/3/10讲解：XX34 B、活位模型 活位模型认为：在所有吸附在金属颗粒表面的分 子中，只有当其吸附在金属颗粒表面某种特殊的 位置(活位)的才能产生强的表面增强拉曼信号。 总的来说，物理类模型所涉及的分子与金属 间作用为物理吸附，具有长程效应，它的代表为 EM 模型。化学类模型强调吸附分子与金属基底 间的吸附，具有短程效应，它的代表为 CT 模型 。 2021/3/10讲解：XX35 5、SERS应用 5

20、.1 SERS检测微量添加物的研究 5.1.1 中成药中微量西药成分的研究 中药的荧光现象很强，而荧光是拉曼散射的“硬伤”，特 别是在成分复杂的中药中，西药的光谱信号常常被强荧光 遮盖，常常表现为以上图谱 。 2021/3/10讲解：XX36 SERS可以大大降低荧光的干扰，同时将信号 放大10的n次方倍。以往关于SERS的研究，大都 限于研究纯化合物。因为SERS的高灵敏度SERS 常常作为一种检测器同其它经典方法联用来检测 混合物中的各成分或某些成分，常见的联用方法 有TLC-SERS、HPLC-SERS和CE-SERS等。在混 合物的SERS研究方面，一般是研究同类化合物的 共存情况，且

21、各化合物在浓度数量级上相差不远 。 2021/3/10讲解：XX37 张雁15等人对表面增强拉曼光谱检测 中成药中的西药成分进行了研究。马来酸 罗格列酮和盐酸苯乙双胍都是常用的降糖 类化学药，也是药品市场上常见的非法添 加化学药品种。这两种化学药的特点是每 日服用量低，即非法添加比低，用传统 HPLC方法检测消耗时间长。我们用SERS对 它们的光谱进行了考察，检测速度快，结 果准确，且不需对中成药样品进行任何分 离提取，操作简便快捷。 2021/3/10讲解：XX38 马来酸罗格列酮标准品溶液的 SERS 谱图（C=0.0003% ） 2021/3/10讲解：XX39 添加了不同比例的马来酸罗

22、格列酮的中成药水溶液的SERS 谱图（马来酸罗格列酮添加于中成药中的比例： a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%，f:0% 。 2021/3/10讲解：XX40 盐酸苯乙双胍标准品溶液的 SERS 谱图（C=0.0003% ） 2021/3/10讲解：XX41 添加了微量盐酸苯乙双胍的中成药水溶液的 SERS 谱图 （盐酸苯乙双胍添加于中成药中的比例： a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%。） 2021/3/10讲解：XX42 盐酸苯乙双胍与马来酸罗格列酮标准品混合溶液的 SERS 谱（C=0.0003%） 2021/3/10讲解：XX4

23、3 两种西药添加于中成药中的比例：a:马来酸罗格列酮0.5% ，盐酸苯乙双胍 0.8%；b:马来酸罗格列酮 0.3%，盐酸苯 乙双胍 0.5%；c:马来酸罗格列酮 0.1%，盐酸苯乙双胍 0.3%。 2021/3/10讲解：XX44 5.1.2 苏丹红的表面增强拉曼光谱 苏丹红原料的 SERS 图谱(C=0.0001%) 2021/3/10讲解：XX45 添加了 0.05%苏丹红的番茄酱的 SERS 2021/3/10讲解：XX46 实验初步说明，SERS用于检测复杂混合体 系中的微量特定成分有其独特的优势。实 验不需要对复杂样品进行任何的前处理及 提取分离，可以对其中的微量特定成分进 行直接

24、检测，且检测灵敏度高。整个实验 过程不需要使用有机试剂，经济、快捷、 环保。 2021/3/10讲解：XX47 5.2 快速检测牛奶中的三聚氰胺 目前，检测三聚氰胺的国家标准检测方法为高效液相 色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法三 种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为 2 mg/kg、0.05 mg/kg 和 0.01mg/kg16。但对牛奶收购、运输 环节的三聚氰胺现场快速测定需求，上述技术存在成本高 、检测周期长等缺陷。现场快速测定三聚氰胺的技术成为 食品安全监管部门和生产企业的需求。 赵宇翔17等人采用便携式拉曼检测仪，结合表面增强试剂 技术，牛奶中三聚氰胺检测限

25、可达 2.0 mg/L，且重现性良 好，样品前处理简单，检测时间短，检测成本低，设备操 作相对简捷，适用于食品安全监管部门和食品生产企业。 2021/3/10讲解：XX48 5.2.1 三聚氰胺的表面增强特征光谱图 含 5mg/L 三聚氰胺的牛奶样品的表面增强拉曼光谱 2021/3/10讲解：XX49 5.2.2 灵敏度试验 三聚氰胺梯度浓度对比试验 样品编号三聚氰胺浓度（mg/L) 阴性 阳性 1 2 3 4 5 0 1.0 2.0 5.0 10.0 -(n=15) -(n=15) -(n=0） -(n=0） -(n=0） +(n=0) +(n=0) +(n=15) +(n=15) +(n=

26、15) 2021/3/10讲解：XX50 5.2.3 干扰物质和梯度浓度三聚氰胺混合牛奶 标准溶液的检测 10g/L含氮化合物和梯度浓度三聚氰胺混合牛奶标 准溶液的检测结果见下表，由实验结果可见，三 个分析人员的实验测量结果对 2.0 mg/L 及以上浓 度的样品阳性率达 100 %。 2021/3/10讲解：XX51 表面增强拉曼光谱快速测定牛奶中的三聚氰 胺方法的检测限为 2.0 mg/L；常见的牛奶中的尿 素、亚硝酸钠等共存物均不干扰检测，特异性较 好。该方法操作简单，易于掌握，同时可在很短 的时间内进行检测。整个操作流程从样品制备、 检测、到结果显示一般可在 10 min 内完成，因此

27、 尤其适宜于现场筛检。方法也可适用于食品安全 监管部门和食品生产企业现场的三聚氰胺快速测 定。 2021/3/10讲解：XX52 5.3 SERS快速检测水产品中孔雀石绿 孔雀石绿是一种人工合成的三苯甲烷类碱性染 料,自20世纪30年代起就被广泛用于渔业生产,防治 水霉病。研究发现孔雀石绿易为鱼类吸收并代谢 为无色孔雀石绿,且孔雀石绿及其代谢产物均有毒 性和致癌性。目前检测孔雀石绿的方法很多,国家 标准检测方法为高效液相色谱法、液相色谱-串联 质谱法,检测定量限分别为2.0g/kg、0.5g/kg。 顾振华18等人采用便携式拉曼检测仪,结合表面增 强试剂技术,水产品水样中孔雀石绿检测限可达 5

28、.0g/L,且重现性良好,样品前处理简单,检测时间 短,检测成本低,设备操作相对简捷,适用于食品安 全监管部门和食品生产企业。 2021/3/10讲解：XX53 5.3.1 孔雀石绿的表面特征拉曼光谱图 用表面增强特征拉曼光谱技术对10g/L 孔雀石绿水溶液进行测定,表面增强拉曼光谱 显示432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1处有孔雀石绿的特征峰,可做孔雀石绿定 性检测的依据。如432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1,同时出现波峰,且强度大 于1000,则证明样品中含有孔雀石绿。 2021/3/10讲解：XX54

29、含10g/L孔雀石绿水溶液的表面增强拉曼光谱 2021/3/10讲解：XX55 5.3.2 灵敏度试验 孔雀石绿梯度深度对比实验 1.0 2.0 5.0 10.0 (n=0) (n=0) (n=15) (n=15) 2021/3/10讲解：XX56 5.3.3干扰物质和梯度浓度孔雀石绿混合 标准溶液的检测 （n=0)(n=15) （n=0) （n=0) （n=0) （n=0) （n=0)(n=15) (n=15) (n=15) (n=15) (n=15) 2021/3/10讲解：XX57 5.3.4 水产品水样的检测 孔雀石绿现场样品检测的结果比较 由表可见,对水产品养殖水中孔雀石绿总含量大于5.0g/L 的水样检测结果均为阳性,阳性符合率达100%；对水产品 未检出(检出限0.5g/L)孔雀石绿的水样检测结果均为阴性, 阴性符合率达100 %。 2021/3/10讲解：XX58 表面增