第五章 工业微生物育种诱变剂

1、第五章第五章 工业微生物育种诱变剂工业微生物育种诱变剂 诱变剂：诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。远超过自发突变率的物理因子或化学物质。 （1）物理诱变剂）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等磁波等 （2）化学诱变剂）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。化肥、化纤等。 （3）生物诱变剂）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄，如真菌的代谢产物、病毒、

2、寄 生虫等。生虫等。 生物体内还有一些生物体内还有一些内源性内源性诱变剂。内源性诱变剂是诱变剂。内源性诱变剂是 在人体健康异常的情况下产生的，如遗传因素、内在人体健康异常的情况下产生的，如遗传因素、内 分泌紊乱等。分泌紊乱等。 第一节第一节 物理诱变剂物理诱变剂 物理诱变剂是指通常使用的物理辐射中的各种射线。物理诱变剂是指通常使用的物理辐射中的各种射线。 射线包括：射线包括：紫外线、紫外线、X射线、射线、射线、快中子、射线、快中子、射射 线、线、射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇 宙线等。宙线等。 物理辐射物理辐射分为分为电离辐射电离辐射和和非电离

3、辐射非电离辐射，都是以量，都是以量 子为单位的可以发射能量的射线。子为单位的可以发射能量的射线。 电离辐射：电离辐射：X射线射线和和射线射线、快中子快中子 非电离辐射：非电离辐射：紫外线紫外线 射线的种类射线的种类 室外活体辐照圃 室内辐照源 辐射离我们有多远辐射离我们有多远 在我们的生活环境中，辐射无处不在！在我们的生活环境中，辐射无处不在！ 家用电器：家用电器：微波炉、吸尘器、电视、电冰箱、空调等；微波炉、吸尘器、电视、电冰箱、空调等； 办公设备：办公设备：手机、电脑、复印机、电子仪器、医疗设备等手机、电脑、复印机、电子仪器、医疗设备等 家庭装饰家庭装饰：大理石大理石、复合地板、墙壁纸、涂

4、料等、复合地板、墙壁纸、涂料等 周边环境：周边环境：高压线、变电站、电视（广播）信号发射塔等高压线、变电站、电视（广播）信号发射塔等 自然环境：自然环境：太阳黑子等太阳黑子等 一、物理诱变剂的生物学效应一、物理诱变剂的生物学效应 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高 能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的 一系列复杂的连锁反应过程。分为一系列复杂的连锁反应过程。分为物理、物理物理、物理 化学、化学和生物学化学、化学和生物学等几个阶段。等几个阶段。 电离辐射主要引起电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色上的基

5、因突变和染色 体的畸变。体的畸变。 非电离辐射主要导致形成非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体嘧啶二聚体。 二、辐射引起生物效应的因素二、辐射引起生物效应的因素 辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内 在遗传因素，也受外界环境条件的影响。在遗传因素，也受外界环境条件的影响。 w微生物的遗传背景微生物的遗传背景 w微生物的生理状态微生物的生理状态 w可见光可见光 w水分水分 w温度温度 w空气或氧气空气或氧气 三、非电离辐射三、非电离辐射紫外线紫外线 紫外线是紫外线是电磁波谱电磁波谱中波长从中波长从0.010.40微米微米辐射辐射 的总称，不能引起人们的视觉

6、。电磁谱中波长的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01 0.04微米辐射，既微米辐射，既可见光可见光紫端到紫端到X射线射线间的辐射。间的辐射。 1801年德国物理学家年德国物理学家里特里特发现在日光光谱的紫发现在日光光谱的紫 端外侧一段能够使含有溴化银的照相底片感光，因而端外侧一段能够使含有溴化银的照相底片感光，因而 发现了紫外线的存在。发现了紫外线的存在。 自然界的主要紫外线自然界的主要紫外线光源光源是是太阳太阳。太阳光透过大气。太阳光透过大气 层时波长短于层时波长短于29010-9米的紫外线为米的紫外线为大气层大气层中的中的臭臭 氧氧吸收掉。人工的紫外线光源有多种气体的吸收掉。人工

7、的紫外线光源有多种气体的电弧电弧(如如 低压汞弧、高压汞弧低压汞弧、高压汞弧)，紫外线有化学作用能使照相，紫外线有化学作用能使照相 底片感光，荧光作用强，底片感光，荧光作用强，日光灯日光灯、各种、各种荧光灯荧光灯和农业和农业 上用来诱杀害虫的上用来诱杀害虫的黑光灯黑光灯都是用紫外线激发荧光物质都是用紫外线激发荧光物质 发光的。紫外线还可以防伪。紫外线还有生理作用，发光的。紫外线还可以防伪。紫外线还有生理作用， 能杀菌、消毒、治疗能杀菌、消毒、治疗皮肤病皮肤病和和软骨病软骨病等。紫外线的粒等。紫外线的粒 子性较强，能使各种金属产生子性较强，能使各种金属产生光电效应光电效应。 紫外线强烈作用于皮肤

8、时，可发生光照性紫外线强烈作用于皮肤时，可发生光照性皮炎皮炎， 皮肤上出现皮肤上出现红斑、痒、水疱、水肿红斑、痒、水疱、水肿等；严重的还可引等；严重的还可引 起皮肤癌。起皮肤癌。 紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、 体温升高等。作用于眼部，可引起体温升高等。作用于眼部，可引起结膜炎结膜炎、角膜炎角膜炎， 称为光照性眼炎，还有可能诱发称为光照性眼炎，还有可能诱发白内障白内障，在焊接过程，在焊接过程 中产生的紫外线会使中产生的紫外线会使焊工焊工患上患上电光性眼炎电光性眼炎。 目前，国内外的标准对纺织品的防紫外线性能一目前，国内外的标准对纺织品的

9、防紫外线性能一 般都使用般都使用UPF值值，即紫外线防护系数值进行评定。，即紫外线防护系数值进行评定。 uUPF值值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，值，UPFUPF值越大，表明防紫外线性能越好。值越大，表明防紫外线性能越好。 u只有当只有当UPFUPF3030时，并且时，并且UVAUVA的透过率小于的透过率小于5 5时，才时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30UPF30； 1.1.而当而当UPFUPF5050时，则表明该产品的紫外线防护性能极时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为佳

10、，防护等级标识为UPF50UPF50。 UPF范围范围防护分类防护分类紫外线透过率（）紫外线透过率（）UPF标识标识 1524较好防护较好防护6.74.215，20 2539非常好的防护非常好的防护4.12.625，30，35 4050，50非常优异的防护非常优异的防护 2.540，45，50，50 （一）紫外线的诱变机制和（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复损伤修复 1. 紫外线的诱变机制紫外线的诱变机制 紫外线引起：紫外线引起： u DNA与蛋白质的交联；与蛋白质的交联； u 胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用； u DNA链的断裂；链的断裂； u 嘧啶二聚体嘧啶

11、二聚体的形成（单链上相邻两个胸腺嘧啶之的形成（单链上相邻两个胸腺嘧啶之 间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间）。间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间）。 紫外线可使空气中的紫外线可使空气中的2分子变成分子变成3臭氧易分解放臭氧易分解放 出原子氧出原子氧强杀菌作用。强杀菌作用。 2 紫外线 紫外线 O3 O2 O 2. DNA损伤修复损伤修复 包括光修复、切补修复、重组修复、包括光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统修复系统 及聚合酶的校正作用。及聚合酶的校正作用。 （1）光复活）光复活 一般微生物中都存在光复活作用，紫外线诱变时，一般微生物中都存在光复活作用，紫外线诱变时，照照 射或分离均应在红光

12、下进行。射或分离均应在红光下进行。 （2）切补修复）切补修复 在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。加入某些物质，提高突变频率。 （二）紫外线诱变（二）紫外线诱变 1. 紫外线的有效光谱紫外线的有效光谱 最有效波长为最有效波长为253.7 nm（2537 ），），即即260 nm的紫外的紫外 线。线。 30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外紫外 灯灯80%波长几种在波长几种在2537 ，诱变效果比诱变效果比30W30W的好。的好。 2. 紫外线的辐射剂量紫外线的辐射剂量

13、 绝对剂量单位：绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在菌率在90%99.9%时，诱变效果较好。时，诱变效果较好。 移动式紫外灯移动式紫外灯 15W紫外灯紫外灯 不同微生物所需杀菌时间不同微生物所需杀菌时间 15W功率的紫外灯管和固定距离为功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到照射微生物，要使杀菌率达到9099.9的效果：的效果： 芽孢菌约需芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要13 min；

14、一般微生物营养体照射一般微生物营养体照射35min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.52 min。 紫外线诱变的步骤与方法：紫外线诱变的步骤与方法： （1 1）出发菌株，）出发菌株，把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养 到孢子刚成熟。到孢子刚成熟。 （2）前培养，）前培养，营养丰富的培养基，同时加入抑制修复的物质（咖营养丰富的培养基，同时加入抑制修复的物质（咖 啡碱或异烟肼），达到最佳生理状态。啡碱或异烟肼），达到最佳生理状态。 （3）制备菌悬液；）制备菌悬液； （4）紫外线照射，紫外线照射，暗室进行，或诱变后立即浸入冰

15、水中暗室进行，或诱变后立即浸入冰水中12 h， 低温抑制突变修复。低温抑制突变修复。 （5）后培养，）后培养，根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适 合于正突变体繁殖的培养基，在适宜温度下培养合于正突变体繁殖的培养基，在适宜温度下培养1.52 h。 （6）稀释涂皿，稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀 释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培 养后，挑取菌落，以待筛选。养后，挑取菌落，以待筛选。 四、电离辐射四、电离辐射 伦

16、琴和伦琴和X射线射线 河南杞县河南杞县“杞人忧钴杞人忧钴” 四川成都放四川成都放60CO运输运输 2. 电离辐射剂量电离辐射剂量 快中子：快中子：拉德（拉德（rad）；）；伦琴（伦琴（R） 致死率达到致死率达到5085比较合适，诱变剂量大约在比较合适，诱变剂量大约在 1530krad(千拉德千拉德)。 X射线和射线和射线：伦琴（射线：伦琴（R） 伦琴：伦琴：1cm 3干燥空气在 干燥空气在0，1.10310 5Pa （760mmHg气压下）产生气压下）产生2.08109离子时所需的离子时所需的 能量。能量。 达到达到1/1000的菌体生存率，剂量大约在的菌体生存率，剂量大约在1万万20 万万R

17、。 3. 电离辐射的照射方法电离辐射的照射方法 u直接对平皿上生长的菌落进行照射；直接对平皿上生长的菌落进行照射； u菌悬液置于试管内并浸入冰水中照射。菌悬液置于试管内并浸入冰水中照射。 处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。 宇宙射线宇宙射线 五、近年来发展的新型诱变剂五、近年来发展的新型诱变剂 1. 微波微波 微波对微生物的诱变效应有微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即个方面的因素，即 热效应和非热效应。热效应和非热效应。 热效应热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果；达到灭菌的

18、效果； 非热效应非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。 2. 红外射线红外射线 红外辐射能促进菌体代谢，提高对紫外损伤的抗性。红外辐射能促进菌体代谢，提高对紫外损伤的抗性。 在紫外线中增加红外辐射可显著提高诱变效果。在紫外线中增加红外辐射可显著提高诱变效果。 3. 激光激光 又称光微粒。可引起又称光微粒。可引起DNA、染色体畸变效应，酶的激染色体畸变效应，酶的激 活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等。活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等。 4. 高能电子流高能

19、电子流 原生质体诱变原生质体诱变 u 当当真空真空中有一束离子束射向一块固体材料时，离子束把中有一束离子束射向一块固体材料时，离子束把 固体材料的原子或分子撞出固体材料表面，这个现象叫固体材料的原子或分子撞出固体材料表面，这个现象叫 做做溅射溅射； u而当离子束射到固体材料时，从固体材料表面弹了回来，而当离子束射到固体材料时，从固体材料表面弹了回来， 或者穿出固体材料而去，这些现象叫做或者穿出固体材料而去，这些现象叫做散射散射； u另外有一种现象是，离子束射到固体材料以后，受到固另外有一种现象是，离子束射到固体材料以后，受到固 体材料的抵抗而速度慢慢减低下来，并最终停留在固体体材料的抵抗而速度

20、慢慢减低下来，并最终停留在固体 材料中，这一现象就叫做材料中，这一现象就叫做离子注入离子注入。 在半导体材料掺杂，金属、陶瓷、在半导体材料掺杂，金属、陶瓷、高分子聚合物高分子聚合物等等 的表面改性上获得了极为广泛的应用，的表面改性上获得了极为广泛的应用， 5. 离子注入离子注入 离子注入诱变，就是利用离子注入生物体引起遗传物离子注入诱变，就是利用离子注入生物体引起遗传物 质的改变，导致性状的变异，从而达到育种的目的。离子质的改变，导致性状的变异，从而达到育种的目的。离子 注入诱变的优点：注入诱变的优点： （1）离子束与生物体作用离子束与生物体作用，不仅有能量沉积，同时有质，不仅有能量沉积，同时

21、有质 量沉积。量沉积。 （2）由于注入离子的由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量不同电荷数、质量数、能量、剂量 的组合的组合，可提供众多的诱变条件。变异幅度大。，可提供众多的诱变条件。变异幅度大。 （3）离子注入具有作用离子注入具有作用区域的选择性、种类的多样性区域的选择性、种类的多样性， 其作用是局部的、可控制的、可对生物体进行定点区域的其作用是局部的、可控制的、可对生物体进行定点区域的 诱变。诱变。 第二节第二节 化学诱变剂化学诱变剂 化学诱变剂：化学诱变剂：是一类能对是一类能对DNA起作用、改变起结起作用、改变起结 构、并引起遗传变异的化学物质。构、并引起遗传变异的化学物质。 包

22、括：包括：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂碱基类似物、烷化剂、移码突变剂以及其以及其 他种类等。他种类等。 化学突变剂具有化学突变剂具有专一性专一性，只对基因的某部位发生，只对基因的某部位发生 作用。作用。 化学诱变剂的剂量主要决定于其化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度浓度和和处理时间处理时间。 剂量使用原则：剂量使用原则：以诱变效应大，而副反应小为原则。以诱变效应大，而副反应小为原则。 注意：注意：90以上的化学诱变剂以上的化学诱变剂都是都是致癌物质或极毒致癌物质或极毒 药品药品。使用时注意自身安全，并防止污染环境。使用时注意自身安全，并防止污染环境。 一、碱基类似物一、碱基类似物 碱基类似物：

23、碱基类似物：是一类和天然的嘌呤嘧啶等四种是一类和天然的嘌呤嘧啶等四种 碱基分子结构相似的物质。既能诱发正向突变，又碱基分子结构相似的物质。既能诱发正向突变，又 能诱发回复突变。能诱发回复突变。 5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）、）、5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）、）、 5-脱溴尿嘧啶（脱溴尿嘧啶（BUdr）、）、5-碘尿嘧啶（碘尿嘧啶（5-IU）、 2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP）、）、6-巯基嘌呤（巯基嘌呤（6-MP） 常用常用5-BU和和AP。 碱基类似物的诱变作用是取代核酸分子中碱基的碱基类似物的诱变作用是取代核酸分子中碱基的 位置，再通过位置，再通过DNADNA的复制，引起突变，因

24、此也叫的复制，引起突变，因此也叫“掺掺 入诱变剂入诱变剂”，在微生物细胞处在代谢的旺盛期效果最在微生物细胞处在代谢的旺盛期效果最 佳。佳。 同分异构现同分异构现 象，嘧啶分子象，嘧啶分子 以酮式和烯醇以酮式和烯醇 式形式出现；式形式出现； 嘌呤分子以胺嘌呤分子以胺 基和亚胺基互基和亚胺基互 为变构。为变构。 （一）碱基类似物的诱变机制（一）碱基类似物的诱变机制 正常掺入错误复制正常掺入错误复制 错误掺入正常复制错误掺入正常复制 碱基类似物的诱变碱基类似物的诱变可回复突变。可回复突变。 复制期：复制期：细菌采用细菌采用对数期对数期的细胞，霉菌、放线菌的细胞，霉菌、放线菌 采用采用孢子孢子，但要进

25、行前培养，使孢子处于萌动状态，但要进行前培养，使孢子处于萌动状态， 并要加大并要加大5-BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。的浓度，处理过程要进行振荡培养。 2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。 （二）碱基类似物的诱变处理方法（以（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）为例） 5-BU和和5-FU为白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。为白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。 1. 单独处理单独处理 斜面斜面前培养液体培养基（对数期）前培养液体培养基（对数期）离心去除培养液，离心去除培养液， 加入生

26、理盐水或缓冲液，饥饿培养加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养810 h 将将5-BU或或5- FU加入培养液，浓度为加入培养液，浓度为2540g/ml 取取0.10.2ml 涂平板培养涂平板培养 挑单菌落挑单菌落 真菌、放线菌孢子需加真菌、放线菌孢子需加0.11m mg/ml的的5-FU 振荡培养振荡培养 612h。 2. 与辐射线复合处理与辐射线复合处理 联合处理，提高突变率。联合处理，提高突变率。 二、烷化剂二、烷化剂 活性烷基易取代活性烷基易取代DNA分子中活泼的氢原子，从而分子中活泼的氢原子，从而 改变改变DNA分子结构分子结构，引起突变。，引起突变。 单功能烷化剂：单功能烷化剂：对生物毒性

27、小，诱变效应大。对生物毒性小，诱变效应大。 双功能烷化剂：双功能烷化剂：两个烷化基团特异地与两个烷化基团特异地与DNA鸟嘌鸟嘌 呤起反应，很容易在呤起反应，很容易在相对相对DNA链间形成共价链链间形成共价链而产生而产生 交联现象，妨碍双链分开及交联现象，妨碍双链分开及DNA的复制，导致生物死的复制，导致生物死 亡。亡。 综合衡量，综合衡量，乙基功能基乙基功能基诱变效应比诱变效应比甲基功能甲基功能基要基要 强，强，双功能基双功能基和和多功能基多功能基烷化剂比单功能基反应速度烷化剂比单功能基反应速度 快，如硫芥、氮芥等。快，如硫芥、氮芥等。 （一）烷化剂的作用机制（一）烷化剂的作用机制 主要通过烷

28、化基团使主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸分子上的碱基及磷酸 部分被烷化，部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对失误而引起复制时导致碱基配对失误而引起 突变。突变。 突变的主要位点：突变的主要位点：鸟嘌呤的鸟嘌呤的N7，鸟嘌呤的鸟嘌呤的O6、 胸腺嘧啶胸腺嘧啶O4 突变的次要位点：突变的次要位点：鸟嘌呤的鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的腺嘌呤的N7、胞嘧啶胞嘧啶N3 （二）烷化剂的性质（二）烷化剂的性质 u溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。液中容易发生分解。 u大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液大部分半

29、衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。 u 有毒！有毒！ 超级诱变剂超级诱变剂之称，适合诱发营养缺陷型突变株，之称，适合诱发营养缺陷型突变株， 还能使多基因并发突变。还能使多基因并发突变。 NTG在水溶液中随不同在水溶液中随不同pH将产生不同的分解产将产生不同的分解产 物。通常在物。通常在pH 6.0的条件下进行诱变处理，常用磷的条件下进行诱变处理，常用磷 酸缓冲液和酸缓冲液和Tris缓冲液。缓冲液。 1. 1-甲基甲基-3-硝基硝基

30、-1-亚硝基胍（亚硝基胍（NTG或或NG或或MNNG） NTG诱变处理方法：诱变处理方法： 步骤：步骤： 新鲜斜面制备菌悬液；新鲜斜面制备菌悬液； 配制配制NTG母液；母液； 菌悬液和菌悬液和NTG溶液混合保温处理；溶液混合保温处理； 以冷的生理盐水稀释洗涤菌体终止反应。以冷的生理盐水稀释洗涤菌体终止反应。 平皿分离。平皿分离。 其他方法：其他方法：液体培养后直接加入液体培养后直接加入NTG；NTG与琼脂与琼脂 和菌液混合制平板。和菌液混合制平板。 注意：注意： NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手 套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风套，穿

31、工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风 橱中进行。凡接触过橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处的器皿必须及时、单独处 理，例用自来水大量冲洗或用理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的的NaOH浸泡过浸泡过 夜，洗净。夜，洗净。 2. 甲基磺酸乙酯（乙基硫酸甲烷，甲基磺酸乙酯（乙基硫酸甲烷，EMS） EMS诱变处理方法：诱变处理方法： EMS母液配制；母液配制；菌体培养至对数期，制成菌菌体培养至对数期，制成菌 悬液；悬液；两者混合保温处理；两者混合保温处理；以冷的生理盐水稀以冷的生理盐水稀 释洗涤菌体终止反应。释洗涤菌体终止反应。平皿分离。平皿分离。 EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过

32、程，包括配是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配 制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接 触皮肤，所有接触过触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲的器皿，单独用大量水冲 洗洗涤，或用洗洗涤，或用10NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清溶液浸泡过夜，再用清 水冲洗干净。水冲洗干净。 3. 硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DES） DES原液用乙醇助溶，磷酸缓冲液稀释；原液用乙醇助溶，磷酸缓冲液稀释； 菌悬液制备；菌悬液制备；DES和菌悬液混合振荡；和菌悬液混合振荡；终止反终止反 应；平皿分离。应；平皿分离。 4. 乙烯亚氨乙烯亚氨 高浓度短时间处理高

33、浓度短时间处理 三、脱氨基（亚硝氨为例）三、脱氨基（亚硝氨为例） （一）亚硝酸的诱变机制（一）亚硝酸的诱变机制 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分分 子，脱去碱基中的子，脱去碱基中的氨基变成酮基氨基变成酮基，改变，改变碱基氨氢键碱基氨氢键的的 电位，引起转换而发生变异。电位，引起转换而发生变异。 还可引起还可引起DNA两条单链之间交联。两条单链之间交联。 （二）亚硝酸的处理方法（二）亚硝酸的处理方法 1. 试剂的配制试剂的配制 （1）1 mol/L pH 4.5 醋酸缓冲液醋酸缓冲液 （2）0.1 mol/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 （3）0.07

34、 mol/L pH 8.6磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液 2. 处理方法处理方法 孢子悬液、醋酸缓冲液、亚硝酸钠溶液混合保温，孢子悬液、醋酸缓冲液、亚硝酸钠溶液混合保温， 加入磷酸氢二钠溶液，降加入磷酸氢二钠溶液，降pH终止反应。稀释涂平板。终止反应。稀释涂平板。 亚硝酸钠浓度：孢子亚硝酸钠浓度：孢子0.025mol/L；细菌细菌0.05mol/L。 四、移码诱变剂四、移码诱变剂 移码诱变剂与移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺相互结合引起碱基增添或缺 失而造成突变。失而造成突变。 移码诱变剂：移码诱变剂：吖吖啶黄、啶黄、吖吖啶橙、原黄素、啶橙、原黄素、ICR- 171、ICR191等等 1. 吖吖啶化合物的诱变机制啶化合物的诱变机制 移码突变移码突变 2. 吖吖啶黄的性质和使用方法啶黄的性质和使用方法 加入到培养基中制成平板或加到培养液里。加入到培养基中制成平板或加到培养液里。 五、羟化剂五、羟化剂 羟胺（羟胺（HA） 1. 羟胺的诱变机制：羟胺的诱变机制：G:CA:T 2. 羟胺的处理方法羟胺的处理方法 六、金属盐类六、金属盐类 如如氯化锂、硫酸锰氯化锂、硫酸锰等。等。 氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易 溶于水，使用时通常加到培养基中。溶于水，使用时通常加到培养基中。 为了速免受破坏倒平板