《酶的分离和纯化》

1、1 第二章第二章 酶的分离和纯化酶的分离和纯化 Isolation and Purification of enzyme n方法概括方法概括 n原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽 n粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀 或其他方法或其他方法 n细分级：一般采用离子交换层析、凝胶细分级：一般采用离子交换层析、凝胶 层析、亲和层析和电泳层析、亲和层析和电泳 3 第一节第一节 原料选择及预处理原料选择及预处理 n动物原料动物原料：动物组织或脏器（活体取出）：动物组织或脏器（活体取出） 充充 分脱血分脱血 -10 -50保存保存 n植物原料

2、植物原料：植物原料：植物原料 磨碎磨碎 加入缓冲液抽加入缓冲液抽 提提 n植物原料特点：植物原料特点：1）纤维含量高）纤维含量高 2）酚酶活力）酚酶活力 高高 3）缓冲液）缓冲液pH易被细胞内物质改变易被细胞内物质改变 n微生物原料微生物原料：菌体培养：菌体培养 做酶活做酶活时间曲线时间曲线 确定最大酶活时间确定最大酶活时间 4 细胞破碎细胞破碎 n微生物细胞破碎一般采用微生物细胞破碎一般采用 n1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻 复融复融 n2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡 n3）机械法：加磨料

3、；研磨；挤压机械法：加磨料；研磨；挤压 n4）缓冲液抽提缓冲液抽提 n抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加 5mM的的Vc 5 第二节第二节 酶的粗提酶的粗提 n沉淀沉淀 n核酸沉淀：核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸、硫酸 鱼精蛋白、链霉素可使核酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸 沉淀，离心除掉沉淀，离心除掉 （b）加入核）加入核 酸酶将其降解酸酶将其降解 n杂蛋白沉淀：根据目的酶的杂蛋白沉淀：根据目的酶的 特性方法各异特性方法各异 n选择性沉淀（盐析）：最常选择性沉淀（盐析）：最常 用的方法用的方法 6 n沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力沉淀过程中

4、随时监测蛋白浓度和酶活力 n 讨论：讨论： n（a）盐的加入速度合适）盐的加入速度合适 n（b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 n（c）硫铵浓度表示法；饱和度）硫铵浓度表示法；饱和度254.1M n（d）硫铵饱和溶液）硫铵饱和溶液pH7，若目的酶易酸变性必须用，若目的酶易酸变性必须用 缓冲液缓冲液 n（e）硫铵溶液密度较高（）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力），故需较大离心力 n此步可除去此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩 7 透析与浓缩透析与浓缩 n1）透析袋处理：透析袋处理： n透析袋透析

5、袋 0.5M EDTA煮半小时煮半小时 蒸馏水煮半小时蒸馏水煮半小时 反复八次反复八次 带橡皮手套用镊子拿取带橡皮手套用镊子拿取 n2）透析除盐：透析除盐：200倍于被透析物；倍于被透析物；4小时换一次透小时换一次透 析液；监测电导值析液；监测电导值 nSephadex G25 除盐：柱长除盐：柱长50cm；上样小于床；上样小于床 体积的体积的20% n3）浓缩：浓缩：a）火棉胶）火棉胶 b）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG） n c）超滤（）超滤（3-5kg/cm2） d）冻干）冻干 8 透析技术原理图透析技术原理图 9 超滤技术原理图超滤技术原理图 10 第三节第三节 酶的精制酶的精制 一、层

6、析技术（一、层析技术（chromatography） 1）分配层析分配层析：物质在两相中的分配系数不同：物质在两相中的分配系数不同 a）纸层）纸层 b）薄层）薄层(比纸层灵敏比纸层灵敏100倍但剥板困难倍但剥板困难) c）柱层）柱层 2）吸附层析吸附层析（absorption chromatography）：吸附剂对：吸附剂对 通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏 水作用、范德华力和氢键水作用、范德华力和氢键 a）薄层）薄层 b）柱层）柱层 n填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基 磷

7、灰石；常用羟基磷灰石磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电带正电, 稳定范围稳定范围pH5.5- 10, 吸附量吸附量1mg/g湿剂湿剂 11 纸层纸层 12 薄层薄层 13 3）离子交换层析离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离 na）阳离子交换层析）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析）阴离子交换层析 nc）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶维素、离子交换凝胶 nd）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂）实验室常

8、用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAE- Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂；阳离子交换剂CM- Cellulose、CM- Sephadex ne）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒； 改型改型 n阳离子交换剂：阳离子交换剂： 碱碱水水酸酸水水平衡平衡 n阴离子交换剂：阴离子交换剂： 酸酸水水碱碱水水平衡平衡 14 nf）柱层析：床体积等于）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需倍束缚样品需 要量；要量； 径径 高高 = 1 15 ； 上样量不超过上样量不超过 柱体积的柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱注意上样方

9、法）；洗脱 方法有两种方法有两种不连续梯度洗脱和连续梯不连续梯度洗脱和连续梯 度洗脱；分布收集器收集每管度洗脱；分布收集器收集每管2-3ml ng）交换剂后处理：饱和）交换剂后处理：饱和NaCl水水酸或酸或 碱碱水水平衡平衡 15 连续梯度洗脱连续梯度洗脱 n梯度混合器 16 离子交换层析离子交换层析 n阳离子交换剂阳离子交换剂 n阴离子交换剂阴离子交换剂 17 Anion exchange chromatography 18 4）凝胶层析（分子筛层析）（凝胶层析（分子筛层析）（gel filtration gel filtration chromatographychromatography

10、）：根据分子量大小予以分离：根据分子量大小予以分离 na）凝胶预处理：凝胶）凝胶预处理：凝胶浸入洗脱液浸入洗脱液轻轻搅拌轻轻搅拌 n n 加热加热90-100（水浴加热）（水浴加热） nb）层析柱准备：）层析柱准备：2.5100柱；柱； 稠胶灌柱；稠胶灌柱； 2-3个个 床体积的缓冲液平衡；床体积的缓冲液平衡； 流速流速16-18ml/h nc）层析：兰葡聚糖（分子量）层析：兰葡聚糖（分子量2106）验柱并求外水）验柱并求外水 体积（体积（V0）；上样量）；上样量1-5% ； n恒压洗脱；恒压洗脱； 流速流速16-18ml/h nd）凝胶后处理：）凝胶后处理：0.5N NaOH+0.5N Na

11、Cl处理后处理后4 保存保存 n长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存 19 凝胶过滤层析原理图凝胶过滤层析原理图 20 Gel filtration chromatography 21 5）亲和层析亲和层析（affinity chromatography） 特异性结合特异性结合 na）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 nb）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽 的的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性

12、、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 nc）配体的选择：有亲和力但不易过大）配体的选择：有亲和力但不易过大 nd）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） ne） 吸附剂的衍生物：支持物吸附剂的衍生物：支持物+空间臂空间臂 nf） 层析条件的选择：蛋白质层析条件的选择：蛋白质+配体配体 蛋白质蛋白质-配体复合物配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋

13、白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性），起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件 22 亲和层析原理亲和层析原理 23 Affinity chromatography 24 二、超离心技术超离心技术 利用物质的沉降系数、质量、利用物质的沉降系数、质量、 浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离 nF = w w2r （F 相对离心力相对离心力RCF；RCF以以g的倍数表的倍数表 示）示） n

14、RCF = w w2r/980 w = w = ( (转数转数/ /分）分）/ 30/ 30 n RCF = 1.11910-5 r(转数转数/分分)2 n离心机：离心机： na) 桌式：桌式：3000转转/分分 红血球、酵母细胞等粗沉淀物红血球、酵母细胞等粗沉淀物 nb) 高速离心机：高速离心机：20000 25000转转/分分 一般实验使一般实验使 用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降 nc) 超速离心机：超速离心机：75000转转/分分 分子生物学必备；能分分子生物学必备；能分 级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器 25

15、 二、电泳（二、电泳（electrophoresiselectrophoresis）技术）技术 n1）原理：原理：M =d L / E t M: 迁移率迁移率 L: 颗粒泳动距离颗粒泳动距离 t: 通电时间通电时间 E: 电势差电势差 n迁移率与下列因素有关：迁移率与下列因素有关：a）样品带电状态、分子形状）样品带电状态、分子形状 与大小与大小 b）电场强度）电场强度 c）缓冲液）缓冲液pH的和离子强度的和离子强度 d）支持介质的阻力、吸附作用）支持介质的阻力、吸附作用 n2）电泳类型：）电泳类型：a）纸电泳）纸电泳 b）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳 c）琼脂糖电泳）琼脂糖电泳 d）聚丙

16、烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳 26 PAGE和和SDS-PAGE n聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%； 过硫酸胺过硫酸胺,0.01-0.03%； n等电聚焦等电聚焦(isoelectric focusing)：两性电解质在电场作：两性电解质在电场作 用下建立一个用下建立一个pH梯度分离蛋白质梯度分离蛋白质 n电泳检测：电泳检测：a）考马斯亮兰（氨基黑）染色法）考马斯亮兰（氨基黑）染色法 nb）荧光染色法）荧光染色法 c）特异酶检测）特异酶检测 d）其他染色法）其他染色法 27 盘状电泳（盘状电泳（A）和平板电泳（）和平板电泳（B） 28 第四节

17、第四节 提纯过程中的定量提纯过程中的定量 n蛋白质浓度：蛋白质浓度：1）双缩脲法：）双缩脲法：Cu+与肽键及酪氨酸残基络合显与肽键及酪氨酸残基络合显 色；测定浓度色；测定浓度0.5-10mg/ml n2）Lowry法：双缩脲法的改进，法：双缩脲法的改进，Cu+与蛋白质在碱性溶液中与蛋白质在碱性溶液中 络合，此络合物还原络合，此络合物还原Folin试剂，测定浓度试剂，测定浓度20-400g/ml n3)紫外吸收法：紫外吸收法：Tyr、Trp、 Phe在在280nm有最大光吸收，此有最大光吸收，此 方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差 测定浓度测定浓

18、度 0.1-0.5mg/ml n4 ） B r a d f o r d 法法 : 该 法 是 根 据 蛋 白 质 与 考 马 斯 亮 蓝该 法 是 根 据 蛋 白 质 与 考 马 斯 亮 蓝 （coomassie brilliant blue）结合产生的蓝色物质在）结合产生的蓝色物质在 595nm有最大光吸收来测定蛋白质浓度的。该方法简单、快有最大光吸收来测定蛋白质浓度的。该方法简单、快 速、可靠、灵敏度高，可测定速、可靠、灵敏度高，可测定1-10m mg的蛋白质。的蛋白质。 n酶活力：检测目的酶的活力酶活力：检测目的酶的活力 n目的蛋白（非酶）检测较困难目的蛋白（非酶）检测较困难 29 第一

19、次比活力 每次比活力 纯化倍数 = 回收率% = 100 第一次总活力 每次总活力 30 酶的提纯过程记录格式酶的提纯过程记录格式 步骤步骤 总体积总体积 （ml） 蛋白总蛋白总 量量 （mg） 总活总活 力（力（u） 比活比活 力力 （ u/m g） 回收回收 率率 （% ） 提提 纯纯 倍倍 数数 粗抽提液粗抽提液 50热变性除杂热变性除杂 硫铵分级沉淀（硫铵分级沉淀（ 30%-50%） DEAE-纤维素纤维素 离子交换离子交换 凝胶过滤凝胶过滤 SephadexG- 100 1000 1000 250 25 10 12000 8000 750 35 9.2 5000 48000 2730

20、 1820 1700 0.416 0.80 3.67 52 185 100 96 55 36.4 34 1.00 1.44 8.83 125 444 31 第五节第五节 酶蛋白分子量的测定 n渗透压法渗透压法 n超速离心法超速离心法 n凝胶层析法凝胶层析法 nSDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法 32 渗透压法渗透压法 nM为蛋白质的摩尔质量（分子量），为蛋白质的摩尔质量（分子量），R 为气体常数（为气体常数（0.082升升大气压大气压/摩尔摩尔/ 度），度），T为绝对温度。为了测定蛋白质为绝对温度。为了测定蛋白质 的分子量，分别取几个不同的蛋白质浓的分子量，分别取几个不同的蛋白质浓 度度

21、c，测出对应的渗透压，测出对应的渗透压，然后以，然后以/c 对对c作图，并作延长线外推至作图，并作延长线外推至c=0，得，得 到的到的y轴截距即为轴截距即为lim/c的值，代入上的值，代入上 式可求得分子量式可求得分子量M。 n渗 透 压 法 适 合 测 定 分 子 量 范 围 在渗 透 压 法 适 合 测 定 分 子 量 范 围 在 10,000100,000的蛋白质。其优点的蛋白质。其优点 是实验装置简单，测定也较为准确；缺是实验装置简单，测定也较为准确；缺 点是要求蛋白样品纯度高，否则测出的点是要求蛋白样品纯度高，否则测出的 将是溶液中各种蛋白的平均分子量。将是溶液中各种蛋白的平均分子量。 33 超速离心法超速离心法 )1 ( = D SRT M nM：分子量：分子量 S： 沉降系数沉降系数 R：气：气 体常数体常数 T：绝对：绝对 温度温度 D：扩散系：扩散系 数数 ：溶质分子：溶质分子 微分比容微分比容 ：介：介 质密度质密度 34 SDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法 M 被测蛋白分子量被测蛋白分子量 a，b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得 de 酶蛋白的泳动距离酶蛋白的泳动距离 do 小分子染料的泳动距离小分子染料的泳动距离