粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清tnfα、il8的影响课件

1、粪菌移植对炎症性肠病大鼠粪菌移植对炎症性肠病大鼠 血清血清TNF-TNF-、IL8IL8的影响的影响 专专 业：普通外科业：普通外科 粪菌移植对溃疡性结肠炎粪菌移植对溃疡性结肠炎 大鼠血清大鼠血清TNF-TNF-、IL8IL8的影响的影响 溃疡性结肠炎溃疡性结肠炎(UC)(UC)是一种病因和患病机制还 未完全阐明，可能与微生态环境、黏膜的免疫应 答、应激、遗传等因素有关的慢性肠道炎症性疾 病，病变主要局限于结直肠粘膜及粘膜下层，可 累及整个结肠甚至末端回肠。目前研究发现，与 健康人相比，UC患者肠道中微生物的多样性减少 约1/4，拟杆菌门与厚壁菌门在总菌群中所占比 例明显减少，而放线菌门与变形

2、菌门的比例明显 增加。肠道菌群是机体一个特殊器官，其调节机 体免疫、调控炎症、参与物质代谢等方面发挥重 要作用。 粪菌移植粪菌移植（fecal microbiota fecal microbiota transplantationtransplantation，FMTFMT），），是将健康人粪便中 的功能菌群移植到菌群分布异常的患者胃肠道 内，重建其健康的菌群分布结构，实现肠道及 肠道外疾病恢复的一种治疗方式。现阶段，FMT 研究大部分是关于FMT治疗复发性难辨梭状芽孢 杆菌感染（CDI）和炎症性肠病（IBD）的个案 或系列病例报道,但FMT导致患者肠道菌群具体 发生何种有益变化及其潜在的机制

3、仍不完全清 楚，但有待进一步研究。对常规治疗失败或有 手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择。 肠道菌群的生理作用肠道菌群的生理作用 1.防御病原体的侵犯 2.物质代谢作用 3.生长与衰老 4.合成维生素 5.肠道的生物、免疫屏障作用 传统的升阶治疗方案传统的升阶治疗方案，序贯地应用5-氨基水杨酸、糖皮 质激素与免疫抑制剂，无疑最为安全易行、经济实用；然 而无限期地等待疗效，可能错失治疗良机，延误缓解时间 ，使约50患者仍处于活动状态，导致失用或致残的并发 症，其疗效费用比反而降低。随着新药问世后治疗经验的 积累，专家们提出早期、强力治疗，即降阶治疗方案降阶治疗方案。 这种看似昂贵、危险

4、，实则经济、高效的治疗方法已使相 当多的IBD患者获益，但降阶治疗药物昂贵，又有一定风险 ，如严重感染、药物反应等，对非选择性病例也存在过度 治疗之嫌，而且停药或减药后病情仍会发复发作，并表现 出一定的激素依赖性。对常规治疗失败或有手术禁忌证的 UC病人，FMT或许是不错的选择。 目前目前FMTFMT应用应用最为广泛的是治疗复发性难治性难辨梭状芽 胞杆菌感染(CDI)肠炎，其短期缓解率可达90以上。FMT 也在其他多种疾病中被用于试验性治疗，都取得了良好的 效果，如IBD、IBS、肥胖、代谢综合征、糖尿病等。还有 FMT被成功运用于系统性硬化病、帕金森病、慢性疲劳综 合征和特发性血小板减少性紫

5、癜等的个案报道。 1 1 3 3 2 2 4 4 1 溃疡性溃疡性性结肠炎大鼠模型建模成功评判标准性结肠炎大鼠模型建模成功评判标准 研研究内内容 拟拟解决决的关关 键问题键问题 1 2 3 研究目标研究目标 l粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-TNF-、 IL-8IL-8的影响的影响 l实验分组、建实验分组、建立溃疡性结肠炎的大鼠模型立溃疡性结肠炎的大鼠模型 l粪菌液的制备粪菌液的制备 l指标检测、指标检测、 Chiu Chiu氏氏6 6级评分法评估损伤程度级评分法评估损伤程度 （1 1）分组情况）分组情况 （2 2）模型建立）模型建立 （3 3）粪菌液的制备

6、）粪菌液的制备 （4 4）指标检测）指标检测 （5 5） ChiuChiu氏氏6 6级评分法评估损伤程度级评分法评估损伤程度 （6 6）统计学分析）统计学分析 2 2 2.12.1分组情况分组情况 健康SD大鼠54只，雌雄各半，体重200-250g，由 山西医科大学生理实验室提供。随机分成3组：空 白对照组(A组)、模型对照组（B组）、粪菌液模 型组（C组），每组18只。其中A组为正常大鼠， 给予无菌生理盐水保留灌肠，每天一次，自由饮 水、进食。B、C两组为溃疡性结肠炎模型大鼠， 分别给予无菌生理盐水、粪菌液保留灌肠，每天 一次，自由饮水、进食。（生理盐水量、粪菌液 量按体重换算） 2.22.

7、2模型建立模型建立 大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，称重后，3 的戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，52，4， 6-三硝基苯磺酸(TNBS W/V)按100 mg/kg加入等体 积50%乙醇溶液；体位为头朝下，用聚丙烯管插入 肛门上段8 cm，注射器注人。再倒立15 min左 右，以防药液溢出，一次性灌肠。 2.32.3粪菌液的制备粪菌液的制备 粪菌液制备流程粪菌液制备流程：将约5g供体（A组）新鲜粪便 样本置于搅拌器中，加入25 mL无菌09NaCl溶 液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤 网过滤去除其中的大颗粒物质；2 h内将样本在 氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步

8、 匀质处理；浆体逐级经过直径2浆体逐级经过直 径20 mm、10 mm、05 mm和025 mm的不锈 钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物 质；将再次过滤的样本以6000转/min的速率离 心15 min，并将沉淀再悬浮于09NaCl溶液中 ，得几乎无色无味的粪菌液。获得的新鲜粪菌液 可立即进行移植，也可加入无菌甘油后置于一 80作为冰冻样本保存18周。 2.42.4指标检测指标检测 2.5Chiu2.5Chiu氏氏6 6级评分法评估损伤程度级评分法评估损伤程度 分别于造模后3d、7d、11d每组各取6只大鼠，3戊 巴比妥钠麻醉后开腹，使用一次性采血针穿刺门静脉取全 血2ml，待低温离

9、心后，再吸出上清液，置于一80冰箱中 保存备用，采用酶联免疫法（ELISA）测定血清TNF-、 IL-8浓度。取肛门以上8cm肠段卷起，置10中性甲醛中固 定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜下观察。并且于取 材完毕后采用颈椎脱臼法处死相应大鼠。 2.6 统计学分析统计学分析 采用Spss13.0统计软件包进行分析，各组实验数据用均数 标准差表示，血清学指标比较采用单因素方差分析，P 0.05表示差异有统计学意义。 3 3 TNF-TNF-主要由脂多糖(LPS)激活的单核巨噬细胞产生，对免疫 反应、机体代谢、炎症反应、抗肿瘤均有重要的调节介导作用。 1.1.溃疡性结肠炎中TNF-分泌水平及其m

10、RNA表达高于正常组或未 受累结直肠粘膜。 2.2.TNF-不仅能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、上皮 细胞和内皮细胞分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶，还 能吞噬细胞产物和补体片段引起细胞坏死、间质中蛋白质破坏和 水肿的发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。 3.3.TNF-可使中性粒细胞聚集，内皮细胞粘附分子上调以及增加 上皮紧密连接的通透性和抑制上皮细胞的生长等，还可诱导结肠 上皮细胞凋亡，破坏肠粘膜屏障，同时血管系统也遭到破坏，通 过以上途径导致一系列溃疡性结肠炎典型的炎症病变。 IL-8 IL-8 是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化 因子，由单核细胞、上皮细胞、表皮细胞、纤维

11、 母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF 和外源性因子细 菌多糖(LPS)的刺激下产生,其主要生物学作用是 1.趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶 体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和T 细胞也 有一定的趋化作用。 2.临床试验发现IL-8 在UC 患者的肠黏膜上皮中 高表达并且IL-8 水平与结肠炎的严重程度呈正相 关。 技技 术术 路路 线线 图图 SD大鼠大鼠 空白对照组空白对照组模型对照组模型对照组 血清血清TNF-、IL8IL8浓度并取结直肠组织浓度并取结直肠组织HE染色后光镜观察染色后光镜观察 数据数据SPSS13.0统计软件分析统计软件分析 粪菌液模型组粪菌液模型组 3 3

12、、7 7、1111天各处死天各处死 6 6只大鼠只大鼠 1 1导师对此项课题有系统、导师对此项课题有系统、 全面的认识与把握全面的认识与把握 2.2.已初步掌握已初步掌握动物饲养及动物饲养及 实验操作的基本要领实验操作的基本要领 3.3.山西医科大学实验中心山西医科大学实验中心 具备本实验相关条件具备本实验相关条件 4 现阶段，现阶段，FMTFMT研究大部分是研究大部分是 关于关于FMTFMT治疗治疗复发性、难治复发性、难治 性性炎症性肠病（炎症性肠病（IBDIBD）的个）的个 案或系列病例报道案或系列病例报道, ,对常规对常规 治疗失败或有手术禁忌证治疗失败或有手术禁忌证 的的UCUC病人，

13、病人，FMTFMT或许是不错或许是不错 的选择，但其作用机制尚的选择，但其作用机制尚 不完全清楚不完全清楚 前期研究工作积累前期研究工作积累 （1 1） 导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富 的临床经验，可为实验提供理论技术指的临床经验，可为实验提供理论技术指导。导。 （2）已参阅大量与课题相关的中英文文献及与 本课题参考性较强的相关资料和理论。 硬件设施基本完备硬件设施基本完备 我校生理实验室具备完成本实验的基本条件：高速冷冻我校生理实验室具备完成本实验的基本条件：高速冷冻 离心机、均浆机、超低温冰箱、氮气操作厨、，可以满离心机、均浆机、超低温冰箱、氮气操作厨

14、、，可以满 足本课题的需求。足本课题的需求。动物中心实验室有饲养动物的动物房动物中心实验室有饲养动物的动物房 和饲养条件和饲养条件。 1. 1.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠 相比，血清TNF-、IL-8检测值较小，说明前者的肠道炎 症反应轻，通透性低，肠屏障功能相比后者较好。 2. 2.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠 相比，结直肠损伤情况判定评分较低。 9月月-3月月4月月-8月月 3月月 文献查阅； 资料收集； 资料分析； 撰写报告。 动物饲养， 做好实验； 收集实验 数据。 整理资料； 分析资料； 统计分析； 撰写论文。 经费预算经费预算 支出科目支出

15、科目 金额金额 （万元）（万元） 计算根据及理由计算根据及理由 合计合计0.80.8 科研业务费科研业务费0.250.25查阅资料、发表论文查阅资料、发表论文 实验材料费实验材料费 0.50.5动物饲养、化学试剂及耗材动物饲养、化学试剂及耗材 0.05仪器设备使用费仪器设备使用费 主要参考文献： 参考文献 1邱新运,刘玉兰. 粪菌移植在疾病治疗中的应用进展.中华内科杂志. 2014, 2Borody TJ，Khomts AFecal microbiota transplantation and emerging applicationJNat Rev Gastroenterol Hepatol

16、，2012，9：88-96 3 Ord6s I，Eckmann L，Talamini M，et a1Ulcerative colitisLancet， 2012，380(9853)：16061619 4 Frank DN，Robertson CE，Hamm cM，et a1Disease phenotype and genotype are associated with shifts in intestinalAssociated microbiota in inflammatory bowel diseasesJ. Inflamm Bowel is，2011，17：179184 5 Bor

17、ody TJ，Khoruts AFecal miembiota transplantation and emerging applicationsJNat Rev Gastroenteml Hepatol，20129(2)：88-96 6 Round JL，Mazmanian SKThe gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and diseaseJNat Rev Immunol。2009 ，9(5)：313-323 7 苏献恩，于文霞，王世宣中华内科杂志，1993：12：842. 8 Ishignro

18、YMucosal proinflammatory cytokine production correlates with endoscopic activity of ulcerative colitisJ Gastroenter011 999；34： 66ol.53 ,NO.11. 主要参考文献： 9Song AL. The severity correlation of TNF-, IL-6 and IL-8 levels in plasma in patients with ulcerative colitis and their clinical significances J.China Prac Med, 2008, 3(36): 3-4. 10 Pearl DS, Shah K, Whittaker MA, et al. Cytokine mucosal expression in ulcerative col