重金属镉对短带鞘藻-活性污泥共生体系脱氮除磷的冲击效应及机制11

1、国家自然科学基金：胞外聚合物在重金属镉冲击小球藻脱氮除磷过程中的作用及机制（1） 镉冲击对小球藻脱氮除磷效率的影响。（2） 镉冲击下氮磷在EPS及藻细胞内分布的变化。（3） EPS在镉冲击下的分布特性变化。（4） EPS与镉的结合方式及其对镉在藻细胞内分布的影响The role of EPS in removal of nitrogen and phosphorus by Chrolla Vulgris with the stress of heavy metal Cadmium and its mechanism藻类生物膜技术具有脱氮除磷的优势，但污水中重金属等毒物可影响藻细胞及其产生在细胞

2、外的大分子聚合物（胞外聚合物，EPS），但目前对EPS在重金属冲击藻类脱氮除磷过程的作用及机制尚不明晰。本项目水环境中优势藻种小球藻为研究目标，为重金属镉为代表，在探明EPS对小球藻脱氮除磷效率影响的基础上，采用三维荧光光谱及傅立叶红外光谱等方法，研究镉冲击下EPS的分布特性变化（分子量分布、可溶态和结合态EPS中主成份含量，亲水与疏水性EPS等）；明确镉冲击下，氮、磷在藻细胞内及EPS的分布比例变化；采用X-射线光电子能谱和扫描透射软X射线显微镜等技术手段深入研究EPS与镉结合的分子模式（结合位点、方式与主要结合物）以及EPS对镉在小球藻亚细胞内分布的影响。研究结果可从分子水平上阐明生物体E

3、PS与重金属的作用机制，对指导藻类生物膜技术在污水脱氮除磷中的运用具有重要意义。藻类广泛存在于水环境中，其生物膜体系在城市污水脱氮除磷的过程中具有良好运用前景。水处理中与氮磷共存表面活性剂等有机污染物，但目前关于表面活性剂胁迫对藻类吸收氮磷的影响缺乏深入认识。本项目以小球藻为代表，研究表面活性剂胁迫对藻类吸收氮磷的影响及分子机制。在了解其吸收不同形态氮磷动力学特征的基础上，考察表面活性剂胁迫下小球藻吸收氮磷的效率。通过测定细胞膜性状，细胞核、线粒体及叶绿体的形态，以及叶绿素含量和净光合作用速率，明确表面活性剂胁迫下氮磷吸收过程中藻细胞性状的变化。构建氮磷诱导小球藻抑制性差减文库，通过全文库测序

4、进行表达序列标签的同源比对和功能分类，筛选出小球藻氮磷吸收的关键基因，并以此为靶基因采用Real-time PCR 技术分析表面活性剂对其转录量的影响，从分子水平上深入阐明胁迫机制。研究成果可丰富水环境中藻类对氮磷的吸收理论，对指导藻类脱氮除磷的实际运用具有重要意义。（4） EPS与镉的结合方式及其对镉在亚细胞内分布的影响选择对照组（无镉）和加镉组的小球藻，在6d的实验过程中，（1）采用X-射线光电子能谱（XPS）研究藻细胞表面C, O, N, S以及Cd元素组成和化合价态变化，探明EPS与镉结合的结合元素与位点；（2）测定EPS中Cd的浓度变化，对比Cd-EPS, Cd-木糖, Cd-酪氨酸

5、和Cd-的K边界X-射线荧光吸收光谱（XAFS）图谱，确定Cd与EPS的主要结合方式与主要结合物。（3）采用扫描透射软X射线显微镜（STXM）观察EPS对镉在小球藻亚细胞内分布的影响，从分子水平上阐明生物体EPS与重金属的作用机制。（4）实验方案：选择对照组（无镉）和加镉组的小球藻，在6d的实验过程中，（1）采用X-射线光电子能谱（XPS）研究藻细胞表面C, O, N, S以及Cd元素组成和化合价态变化。先对每个样品进行全扫描（扫描范围0-1200ev，通道时间100ms, 通过能160ev, 布长为1.0eV），观测藻细胞表面的主要化学元素。然后详细考察藻细胞加入Cd前后，XPS窄区扫描（通

6、道时间250ms，通过能20ev，步长100ev， 曲线用Peakfit v4.12软件进行峰拟合）中C1S, O1S, N1S, S2p以及Cd3d的结合能位移，从而探明Cd加入后，藻细胞表面主要元素的存在状态。（2）提取藻细胞EPS，并选择EPS中可能存在与Cd作用的几种主要成份木糖，酪氨酸和为研究对象，对比Cd-EPS, Cd-木糖, Cd-酪氨酸和Cd-的K边界X-射线荧光吸收光谱（XAFS）图谱，从谱图中曲线的中峰位置和曲线轮廓确定Cd与EPS的主要结合方式与主要结合物。（3）采用扫描透射软X射线显微镜（STXM）观察EPS对镉在小球藻亚细胞内分布的影响，从分子水平上阐明生物体EPS

7、与重金属的作用机制。其中（2）和（3）拟分别采用上海同步辐射光源（STXM）中BeamlineBL14W1D和BL08U1A工作站进行实验研究。一立项依据：水体中氮磷等营养物质的污染已引起普遍关注，我国城镇污水即将执行一级A排放标准（GB18918-2002），氮磷（NH4+-N，TP，TN）的排放标准分别从15，1.0，20 mg/L提高到 8，0.5，15 mg/L，因此对污水脱氮除磷提出了更高的技术要求。与传统的微生物脱氮除磷过程相比较，结合了藻类吸收氮磷优势的藻菌生物膜技术因其效率高、能耗低和藻类可资源化利用的优势受到关注。藻细胞能利用水体中多种无机氮磷和有机氮磷化合物作为氮源和磷源，

8、利用二氧化碳和碳酸盐作为碳源进行光自养生长，并且藻类细胞可以用来去除污水中的营养物质并以有机物的形式将其储存在藻细胞中。20世纪中期，Oswald5和McGriff 6最早提出利用微藻处理污水的想法。20世纪80年代以来，生物技术的飞速发展使藻类大规模培养技术逐步完善。国内外对发挥藻类净化污水的潜力进行了研究并取得很大进展7-9。藻菌生物膜在自然界水体和各种污水处理生物反应器中普遍存在, 它们在自然水体的净化和污水处理中发挥了非常重要的作用, 本课题组前期研究发现，单细胞的小球藻（Chlorella vulgaris）相对其他等淡水藻种对氨氮和磷酸盐具有较高的去除率，在与地衣芽孢杆菌（Baci

9、llus licheniformis）组成藻菌共生体系后，由于细菌促进了藻类生物量和分泌胞外物质，该体系对氨氮和正磷酸盐的去除率达到90.2%和94.8%。藻细胞主要由细胞壁，细胞膜，叶绿体和细胞核等亚细胞器组成，其中细胞壁是藻类吸收利用氮磷等营养物质的第一层通道。藻类细胞壁内部为纤维素结构，而外层多被多聚糖类物质等有机物包裹组成。Wingender等人用缩写“EPS”作为术语来代表细胞外不同的类别的大分子，如多糖，蛋白质，核酸和其他高分子化合物。EPS显著影响了藻类的物理化学性质，包括结构，表面电荷，絮凝，沉降性能，脱水性能和吸附能力。EPS与细胞通过复杂的相互作用，形成大量的一个巨大的网状

10、结构水，保护细胞免受脱水。EPS 以不同形式粘附在藻细胞表面, 增强藻细胞表面的电负性。EPS中碳水化合物和羰基化合物占60%80%以上，Huang 等16通过大量研究发现这些复杂的胞外多糖基本上都由常见的单糖单位组成。 EPS 的成分和释放浓度主要与藻细胞的种类、生长期有关，Hoyer 等18实验发现集胞藻在生长期间释放出质量浓度1.8mgL-1 的EPS，而小球藻的释放质量浓度则达到81 mgL-1。大部分藻类在指数生长期EOM 的释放速率高于稳定期19。在生长后期，随着藻细胞的衰老，粘附于藻细胞壁上的EOM 脱落，释放到水中。EPS作为包裹在藻细胞壁外的重要物质，对藻类吸收利用氮磷等营养

11、物质必然产生影响。李和ganczarczyk（1990）观测到的大量EPS存在于非晶相污泥絮体与周围的细胞，这表明基质必须通过EPS层传递细胞。一般情况下，组分的扩散EPS系数低于水，这意味着EPS影响到营养物质的代谢产物，高浓度的EPS不利于底物传质。此外，EPS给藻类提供了大量可以与其他组份子结合的官能团( 如羧基、氨基、醛基、羟基、巯基、磷酰基及羰基等)。研究表明，在EPS所有官能团中, 多糖提供的羧基最为丰富, 占藻细胞表面将近70%的可滴定位点41。EPS可吸附许多金属和有机物质，如蛋白质中的芳烃、烷烃和碳水化合物的疏水性区域，同时EPS存在官能团的不同也构成了EPS不同的亲疏水性,

12、影响EPS对物质的吸附和传递。补充文献具体说明。在利用藻类去除氮磷过程中，氮磷营养物常与重金属，表面活性剂、芳香烃、农药等有毒污染物共存，因此，在藻类吸收氮磷过程中这些毒物的冲击作用影响不容忽视。课题组前期研究表明，在低浓度的毒物作用（如重金属镉和季铵盐表面活性剂）可对小球藻的生长存在一定刺激效应，促进其吸收氮磷的效率。而当毒物超过一定浓度后，则对小球藻的生长存在抑制效应。这个浓度阈值的浓度与藻种、毒物种类和浓度有关。研究中还观察到，低浓度毒物刺激下小球藻的EPS分泌物量有增加的趋势，据此可以推断EPS影响了藻类吸收利用氮磷的过程。重金属是水处理中一类高出现频率和浓度的毒物，文献报道重金属对藻

13、类具有生态毒性并且由于藻类带有表面负电荷，藻类极容易吸附重金属离子。重金属对藻类的毒性与其存在浓度和形态有关。Xu等研究发现，环境中的农药与Cu作用后，结合成IM-Cu因此降低了Cu对斜生栅藻的毒性。依次推断，EPS可通过与Cd形成新的化合物而增加或者减缓毒物的毒性，另一方面，Cd于EPS后也可以改变EPS的结构和组成，也因此影响了其性质（化学组成，亲疏水性和电荷性等）。这个过程对脱氮除磷的影响是复杂而重要的。藻类生物膜技术具有脱氮除磷的优势，但污水中重金属等毒物可影响藻细胞及其产生在细胞外的大分子聚合物（胞外聚合物，EPS），但目前对EPS在重金属冲击藻类脱氮除磷过程的作用及机制尚不明晰。近

14、年来，一些新的研究手段不断应用到EPS的研究中。如三维荧光光谱(3DEES)。3DEES亦称总发光光谱或激发发射矩阵图, 能够获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息，并且可对多组分复杂体系中荧光光谱激发、 发射、重叠的对象进行光谱识别和表征，是一种很有用的光谱指纹技术。借助3DEES, 学者研究了水处理过程中藻类EPS中主要成份糖类，脂质和类腐殖酸结构及其变化。X射线能谱（XPS）作为一种非常灵敏的固体表面分析技术，是确定样品元素组成和化合价态的有效手段。借助XPS可研究藻细胞表面EPS中的主要化学元素及其与Cd结合后的变化。同时借助同步辐射光源技术，采用X-射线荧光光谱观测加入Cd后

15、，Cd-EPS谱线与Cd与EPS主要成份结构单元木糖，的谱线峰结构与谱线轮廓的变化，以及采用扫描透射软X射线显微镜观测EPS对镉在小球藻亚细胞内分布的影响。综上所述，本项目以水环境中优势藻种小球藻为研究目标，为重金属镉为代表，在探明EPS对小球藻脱氮除磷效率影响的基础上，采用三维荧光光谱及傅立叶红外光谱等方法，研究镉冲击下EPS的分布特性变化（分子量分布，可溶态EPS和结合态EPS，亲水与疏水性等性质）；明确镉冲击下，氮、磷在藻细胞内及EPS的分布比例变化；采用X-射线光电子能谱，X-射线荧光光谱和扫描透射软X射线显微镜等技术手段深入研究EPS与镉结合的分子模式（结合位点、方式与主要结合物）以

16、及EPS对镉在小球藻亚细胞内分布的影响。研究结果可从分子水平上阐明生物体EPS与重金属的作用机制，对指导藻类生物膜技术在污水脱氮除磷中的运用具有重要意义。EPS在藻类包括羧基在内, 这些基团有些可以失去质子而带负电荷, 靠静电引力吸附金属离子; 有的带孤对电子, 可与金属离子形成配位键而络合金属离子, 这些已为不少实验证实。例如, 金属离子( 如Cd2+、Ni2+、Pb2+等) 在pH 值接近羧酸的解离常数时能被最大量、或接近最大量地被藻细胞吸收, 用傅立叶转换红外光谱分析表明, 镉与藻细胞表面的羧基基团形成了桥连或二齿状结构42。在褐藻类中, 第二个最为重要的酸性功能基团是岩藻衣聚糖上的磺酸

17、基团, 其在褐藻生物吸附中也扮演了重要的角色; 此外, 在低pH 值中, 多聚糖上的羟基基团作用也不容小视43。此前, 人们一直认为, 金属离子是通过物理吸附结合到吸附剂高度发达的表面44。然而近来的研究表明, 事实远非如此简单, 如果这种解释成立的话, 那么所依靠的应该是藻细胞高度发达的细胞壁。通过藻细胞对亚甲基蓝的吸附来计算螺旋藻的藻细胞面积发现, 在藻细胞吸附重金属的总量中, 物理吸附不超过其中的3.7%45。阳离子可与分子或带有自由电子对的阴离子( 碱基对) 起络合或螯合反应。藻类细胞对金属离子的吸附也存在这种现象。如海藻细胞硫酸根、氨基、羧基与金属离子有络合现象22,Haug 等50

18、在研究褐藻( Laminaria digitata) 时发现, 金属离子与藻酸盐上基团的亲和力依Cu2+ Ba2+ Ca2+Co2+顺序而减小, Haug 和Smidsrod 解释为金属离子越大, 越有利于同相互之间距离较远的功能基团组成的络合位点相结合。运用X 光衍射以及核磁共振光谱分析,可以直观地看到金属离子与藻酸盐上的配基结合, 进一步的分析发现金属离子络合的方向极有可能是羧基上的氧原子22。目前对金属离子和盐藻衣聚糖之间的络合研究不多, 加强这方面的工作, 将丰富对金属离子和藻细胞之间吸附解吸附关系的理解。探讨了丝藻( Ulothrix sp. ) - 细菌生物膜所分泌的胞外聚合物( EPS) 与藻菌生物膜去除毒性金属Cd 之间的关系。研究结果表明, EPS 主要由丝藻产生, 其含量与污水中Cd 的去除效率及生物膜中Cd 的积累量之间相关性良好。而且, 丝藻所分泌的EPS 为与其共生的细菌及其本身提供了一个缓冲Cd 毒性的微环境, 这使藻