生物大分子分离纯化技术

1、1 生化及临床分析样品的预处理。 生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微 过滤、冷冻干燥及离心技术； 生物大分子的电泳分离纯化技术； 生物大分子的色谱分离纯化技术； 本章主要的内容包括： 2 2.1 生化分析样品的准备与预处理 生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测物 处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并 对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。 3 2.1.1 样品的类型、采集及保存 样品的类型 生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于 动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的 化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简 单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至 整个组织。这些

2、基质非常复杂，常常由多相组成， 如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。 被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存 在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎 是完全稳定的药物的代谢物。 4 样品的采集 对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢 活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。 尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。 组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采 样者应该有相应的样品采集及保存的设备。 5 1. 血样 成人平均含6L的血液、其中约55的血浆和 45的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采 血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的 影响。动物一般采取禁食1216h后采血

3、，一 般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。 6 血样有全血、血浆和血清之分。 7 2组织样品 组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这 类组织是代谢活性的，因此采样后几秒之内要在液 氮中或其它冷却剂中冷冻。 液氮 8 样品的保存样品的保存 一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分 析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也 许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有 的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注 明保存日期及保存条件等。 9 生物体液中许多成分保存在室温或4下时，由于 沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发 生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白 进行

4、分析，当样品保存在-20时，20天内不会发生 明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显 的变化，如儿茶酚胺，因此必须保存于20或70 下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆 或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析 对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。 所以、一般要快速分离成单一的相。 10 样品的初步处理 尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一 些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。 许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除 蛋白质的各种沉淀方法的比较见表： 11 常用蛋白质沉淀方法的比较常用蛋白质沉淀方法的比较 12 2.1.2 2.1.2 酶样品的准

5、备酶样品的准备 酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性 是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物 活性的保持问题。 生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简 单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。 13 酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中， 通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解 和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整 个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的 体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶 对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作 用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的 功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方 面是否具有纯的酶制

6、剂非常关键。 14 酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对 酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护 环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏 感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。 15 可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞 器内的，其蛋白质浓度从100 mg/ml 到高达400 mg/ml (线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还 原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其 它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白 质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护 环境中释放出来被限制在不

7、同部位的蛋白水解 酶也同时被释放出来。所以要对所关心的酶进行 保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。 16 通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的 使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应 控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以 防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25可 以使许多降解过程减慢3-5倍。 17 酶在稀溶液中由于对器皿壁或色谱填料的吸附 会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失去 活性，这种变性可以通过加入载体蛋白来阻止。 比较常用的载体蛋白有牛血清白蛋白，或商品 化的结构简单、分子量已知的合成蛋白。 载体蛋白选择条件： 1. 与酶之间无相互作用； 2.分子量

8、与酶的分子量差至少12倍，以便必要时 可以很方便地用排阻色谱将二者分离。 18 一些特殊的反应会使催化活性部位的活性丧 失一些。在纯化过程中一些辅助因子的失去会使 酶的活性丧失，为此可以在纯化缓冲液中加入辅 助因子。 催化活性部位氨基酸残基的共价化学修饰很 常见，最易被修饰的氨基酸为半胱氨酸。 R-SH+R-SHR-S-S-R 19 对巯基氧化的防止： 1. EDTA络合金属离子(非金属酶) 2. 加入含巯基试剂，如巯基乙醇、2,3-二巯基丙醇、 巯基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等 20 对蛋白质酶解的防止： 蛋白水解酶来自活细胞的内部，哺乳动物将其 包装在溶酶体中，而在微生物中它们则存在于

9、质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取 物时会发生蛋白水解酶的释放，所以对其活性要 进行抑制。根据蛋白水解酶的类型可以选用不同 的抑制剂。 21 常用蛋白酶抑制剂 1. 氟代磷酸二异丙酯(DEP)：可抑制丝氨酸蛋白酶， 但在使用上DEP比较危险，因为它具有挥发性， 并能进攻人的乙酰胆碱酯酶而影响人的神经传导。 2. 苯基甲基磺酰氟(PMSF)：非挥发性丝氨酸酶的 抑制剂，而且不与人的乙酰胆碱酶作用。它还可 以抑制一些巯基蛋白酶及羧酸肽酶。 3. 胃蛋白酶抑制素和甲(乙)酰-亮-亮-精三肽是酸 性蛋白水解酶类很强的抑制剂，被抑制的酶有胃 蛋白酶、组织蛋白酶及酵母蛋白酶A。 22 由于细胞质中

10、含有高达10一15(W/V)的非 水成分，处在蛋白质周围的水分子不能自由流动 而使蛋白质分子的结构加以稳定。在酶提取物制 备过程中为了模拟这种情况，通常加入非水的亲 水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山 梨糖醇。 23 在每步纯化之后都要进行酶活性和蛋白质量 的测定。在纯化过程中酶的比活性(u/mg)逐渐增 加并最终达到最大。酶的粗提物要用硫酸铵或聚 乙二醇(PEG)进行分组沉淀加以浓缩，也可以用 色谱吸附，然后再迅速从色谱基质上解离下来。 沉淀的蛋白质溶解在小的体积中，这样可由于浓 度高而更稳定。离心法(500050000 g)很适合于 亚细胞组分及硫酸铵和PEG沉淀的酶的分离。 24

11、 生理样品中具有生物活性酶的制备生理样品中具有生物活性酶的制备 1酶活性测定过程 确定生理样品中酶的活性一般都要经过以下几个 步骤： (1)酶及反应液的制备，反应液通常由一定浓度的 底物组成，并有确定的温度、pH及其它催化反应所 需要的辅助因子； (2)将酶加入反应液或将反应液加入到酶制剂中并 进行温育以引发反应，随后的测定都以引发反应的 时间为起点； (3)反应可以用不同的方式终止，最常用的方法是 使酶失去活性； 25 (4)将酶反应产物从酶和底物中分离出来； (5)测定和鉴定在特定的时间内由酶反应所生成的产 物； (6)在有些情况下酶的活性可以用反应速度法来测定； (7)数据分析。 26

12、2样品的制备方法 对所有的生物样品(组织、尿液、脑脊髓液及细胞 培养液等)在分析之前都要进行下述准备工作； (1)研究对象的准备(如动物)； (2)标本的采集； (3)由标本制备样品； (4)标本或样品的形态； (5)标本或样品的保存； (6)用于酶法分析样品的预处理； (7)标本是来自于研究对象的一部分，并作为研究的 代表。 27 从生理样品制备具有生物活性的酶时，主要应考 虑两种因素： 1. 选择什么样的生物样品作为进行纯化的起始原料。 如：含有器官、组织、生物液、微生物细胞及从培 养液或发酵液中获得的单细胞生物等；分离开的各 种细胞混合物，经溶解所释放出来的亚细胞碎片， 它们包括像线粒体

13、类的细胞器及膜组分或含可溶性 成分。对这类样品进行处理的第一步是不同细胞器 的分离及可溶物与不溶物的分离，然后对膜成分进 行溶解，最后将不同种类的分子加以分离。 28 2. 样品应纯化到什么程度。 传统的纯化法最终所得到的是均匀的蛋白质溶 液。样品纯化的主要目的是能够分析单一的酶活 性而不受其它物质的干扰。但对有些研究，其它 有活性成分的存在则是有利的或必要的。 29 (1)从组织或器官制备样品 组织和器官至少可以分为两部分，即细胞和细胞 内成分。所感兴趣的成分可能存在于上述两个部分 中的任何一个。将整个未损伤的细胞从稳定的小纤 维基质中分离出来要采用细胞筛选技术。通常所使 用的用于基质破碎的

14、方法(如切、剪、粉碎)会造成 一些细胞的破碎，而利用纯化的酶可以对基质进行 特殊方式的破碎，如胶原酶可用来破碎哺乳动物组 织。使用胰蛋白酶及其它蛋白水解酶也取得了一定 的成功，这样的方法所得到的是细胞的混合物，细 胞内成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶 和试剂。 30 (2)从组织或器官培养液中制备样品 经培养的样品通常可按类似于上面的方法进行。 值得注意的是要避免由于外加的细胞内成分及培 养介质所产生的影响。因为它们中可能含有来自 于介质本身或在样品培养过程中所产生的具有酶 活性的物质。 31 (3)从细胞培养液制备样品 对在培养液中生长的哺乳动物细胞或细菌等样 品，在分析之前要将非细

15、胞成分与细胞成分分开， 细胞与培养液的分离采用低速离心就可以实现， 上清液要进行酶活性分析，滤饼留下来用于溶解 和分析。 总之，酶样品的制备区别于其它的生物大分子， 其预处理过程相对较复杂，应根据实验的要求严 格进行每步操作。 32 2.2 生物样品的常规分离纯化方法 2.2.1 透析(Dialysis) 透析是用于生物大分子分离和纯化的一种简单而古 老的方法，它是在渗透中既有溶剂流动又有溶质流 动的过程。 操作：把待分离或纯化的样品封入由半透膜组成的 透析袋内，然后将袋子放入低离子强度的透析液中 进行透析。根据半透膜规格的不同，只有膜内分子 量小于分子量阻截范围的分子才可以透过膜进入透 析液

16、中，从而实现大分子与小分子的分离或生物大 分子的纯化 33 操作要点： 为了加速透析的进程，一般在透析的过程 中要进行连续搅拌，同时在透析袋内留下大约 透析袋总体积10的空隙，以便使得透析膜界 面两侧能透过膜的分子浓度梯度加大。透析平 衡的时间一般为46小时，进一步透析需要换 液。考虑到被透析的生物分子较高温度下易变 性，透析一般在34C下进行。 34 透析膜 常用的透析膜材料有火棉胶、玻璃纸以及纤维 素等。膜孔径的大小可以有不同的规格，在医药 工业中常使用纤维素透析管，其分子量阻截范围 为1.0 x1035.0 x104。 35 透析管的选择： 主要考虑分子量阻截范围 其次考虑管的尺寸 36

17、 透析管的预处理 透析管使用之前一般要进行适当的处理，以除 去诸如甘油、重金属离子、含硫污染物及可能存 在的蛋白或核酸水解酶类。 1%乙酸 浸泡1h 水洗 碱性EDTA 煮1h 水洗 浸泡水 中保存 37 透析液 最常用的透析液是水，一定pH和离子强度的缓 冲液或高分子惰性物质的浓溶液。在纯的水中透 析一般速度比较快但有造成生物物质活性丧失 的危险。所以，通常选择具有一定pH和离子强度 的缓冲液作为透析液有时也可以选择高分子惰 性物质的浓溶液，因为高分子不会进入膜内而 水分子可以自由出入膜孔。在这种情况下，除了 正常的透析之外，由于膜内外渗透压差的存在， 膜内更多的水会透析到膜外，直到内外渗透

18、压达 到平衡为止，因而，也具有浓缩样品的功能， 38 透析的主要用途是从生物大分子样品中除去盐类或 其它小分子物质。 透析的应用透析的应用 1. 在分离及纯化蛋白质及菌时经常要加入有机溶 剂或无机盐类，如硫酸铵或硫酸钠以沉淀蛋白质 类生物大分于，由于生物大分子在沉淀的同时会 不可避免地混杂有这些小分子，从而干扰生物大 分子的进一步纯化或性质鉴定。透析法是除去这 些小分子的简便而有效的方法。 39 2. 用来除去与生物大分子结合较弱的小分子或离子， 如金属离子及酶的辅助因子NAD，FAD等。当透析 要除去金属离子时常常要在透析液中加适量的螯合 剂(如EDTA)，这样可以加快透析的速度。 3. 用

19、来测定生物大分子(如：核酸及蛋白质)与金属 离子间的亲和常数。例如：可以用Tb3和Eu3作为 Mg2离子的荧光探针来测定Mg2与核酸的亲和常 数，因为这两种稀土离子与镁和钙离子具有相同的 结合位点 透析的应用透析的应用 40 透析法的主要缺点是整个过程需要的时间较长， 有时需要透析几天。因而，近来人们更乐于使用 诸如凝胶过滤(Gel Filtration)及空心纤维过滤器透 析(Hollow Fiber-filter Dialysis)等方法。这些方法 完成同样的任务一般只需要12小时。 41 生化及临床分析样品的预处理。 生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微 过滤、冷冻干燥及离心技术； 生物大分子的电泳分离纯化技术； 生物大分子的色谱分离纯化技术； 本章主要的内容包括： 42 血样有全血、血浆和血清之分。 43 酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对 酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护 环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏 感，细胞膜酶对溶解尤