生物分离工程电泳

1、1 电泳在生化分离中的应用 分离和纯化手段（实验室） 蛋白、酶、核酸纯化 基础理论研究 醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白 琼脂对流免疫电泳分析病人血清，早期诊断肝癌 高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构； 凝胶电泳技术分离分析酶，蛋白质，核酸 2 电泳原理 指带电粒子在电场中朝与自身带相 反电荷的电极移动的现象 CATHODE ANODE +- - + 3 带电颗粒 小离子：Cl-, 甘氨酸离子 生物大分子：蛋白质、核酸等 蛋白质分子是由氨基酸组成的， 而氨基酸带有可解离的氨基和羧基， 是典型的两性电解质，在一定的pH 条件下就会解离而带电 4 用支持体的电泳技术 1. 滤纸电泳2.醋酸纤维薄膜电

2、泳3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 ( 淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等 ) 5.凝胶支持体区带电泳 ( 聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶 ) 不用支持体的电泳技术 Tiselius或微量电泳 操作形式： 1. 区带电泳2.等速电泳3.等电点电泳 电泳形式分类 5 电泳速度 v = EZe/(6r) +- - Z，r E ff E: 电场强度,V/cm Z: 溶质的荷电荷数 ：溶液粘度 e: 1.610-19C 1. 粒子在电场中所受的力: f = EZe 2. 粒子在液体中泳动所受的阻力： 根据Stoke定律 f= 6rv 平衡时：f = f 恒定泳动速度: 溶质的迁移率： u0= v/E=

3、Ze/(6r) 6 区带电泳 7 影响泳动速度的因素 FrictionCharge 外加电流电压 分子量分子形状分子的等电点 Voltage + - - + 8 影响泳动速度的因素-1 带电颗粒的性质 所带净电荷的数量 颗粒大小 形状 v=EZe/(6r) 恒定泳动速度: 9 影响泳动速度的因素-2 粒子的pI和溶液pH值 protein白蛋 白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 pI4.05.065.17.1 白蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 血清中的四种蛋白 pH8.6的电泳缓冲液中电泳，泳动速度： 10 影响泳动速度的因素-3 外加电流电压 U ，E ，v (1) 常压电泳: U=100500V

4、，E=210V/cm t=几小时至数天 适合于分离蛋白质等大分子物质 (2) 高压电泳：U=5001000V，E=50200V/cm t=几分钟 分离氨基酸，肽，核苷酸，糖类等小分子物 质 由于电压升高，电流也随之增大，故需冷 却装置 v=EZe/(6r) 恒定泳动速度: 11 影响泳动速度的因素-4 溶液的离子强度 I = (cizi2 )/2 保持足够缓冲能力前提下，离子强度要 最小 溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速 度越 慢，反之越快 最适离子强度0.02 0.2 12 影响泳动速度的因素-5 电渗作用 在电场中液体对固体支持物的相对移 动 滤纸电泳 Cellulose pH=8.6

5、电泳血清蛋白 + - 球蛋白 - 滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷 与带电颗粒一样可以吸引正离子 介质向阴极移动球蛋白: 颗粒大，净电荷少 13 电渗作用石英毛细管电泳 Capillary Electrophoresis pH3 内表面带负电 毛细管管壁分布有 大量的硅烷醇（Si-OH） 阳离子被吸附在管壁 而形成了双电层 V= V(电渗流)V(电泳) V (正) V (中)V (负) 14 影响泳动速度的因素-6 对支持物的选择 支持物均匀，吸附力小，否则电场强度 不均匀，影响区带的分离 琼脂糖和淀粉在电场作用下易电离带负 电荷，产生电渗流，应用范围受限制。聚 丙烯酰胺凝胶常用。 15 E

6、xample 1 计划在0.82v/cm的电位梯度下，用凝胶 电泳的方法将两种胞外蛋白质分离开来，这两种蛋 白质的迁移率分别为4.110-5和5.1 10-5cm2/V.s。 如果开始时混合物在凝胶上宽度为0.2cm，估计把 这两种蛋白质分开需多长时间？在估算时，可忽略 扩散的影响。 u0 = v/E=eZ/（6r） 6.7hrs102.4t 0.82V/cm/V.s)cm104.110(5.1 0.2cm vv l t 5 255 12 解：溶质的迁移率为： 16 凝胶电泳 17 凝胶电泳法 铸 胶电 泳染色脱色 凝胶电泳 样本处理 Trypsin 浓缩层胶体 分离层胶体取出胶体 染 色 脫

7、 色 18 Pierce 商品供应预铸胶片 梯度或固定浓度胶体 10, 12. 15 样本槽 中性 pH 缓冲液 拋弃式塑料外壳 胶体 1 mm 厚度 19 不连续凝胶电泳系统组成 1 电泳系统pH胶体浓度缓冲液 上层(负极) 缓冲液 2 样本溶液 3 浓缩层胶体 6.8 4 分离层胶体 胶 体 5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-HCl Tris-HCl Tris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 胶体不连续性有浓缩样品的作用 20 浓缩层内的等速电泳 21 浓缩层胶体中的三个主要作用角色 G

8、lycine: Negative charged No net charge Chloride ion: Proteins: 小分子大分子 22 SDS Gel Elecrtophoresis 23 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量 PAGE凝胶电泳分离、检测蛋白质 根据蛋白质分子大小、形状及净电荷 在PAGE中加入一定量的SDS 蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子量大小 24 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量 SDS：阴离子去污剂、水溶液中以单体和 分子团存在。 能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的 非共价键，形成带负电荷的蛋白质-SDS复 合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形 成仅

9、保持原有分子大小为特征的负离子团。 25 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量 操作： 分离胶12%浓缩胶5% 加样 电泳 染色、脱色 凝胶干燥 确定分子量 26 样品分子量的确定 M为蛋白质分子量、m相对迁移率、b为斜率、K 为截距。 一定条件下K和b为常数，根据迁移率可求得分子 量。 lgMw=b*mR+K 蛋白质分子量在蛋白质分子量在15000-200000之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移 率与分子量的对手呈线性关系：率与分子量的对手呈线性关系： 27 样品分子量的确定 相对迁移距离=蛋白质迁移距离/燃料迁移距离 以标准蛋白质相对分子量的对数以标准蛋白质相对分子量的对数(lgMr)为纵座

10、标，为纵座标， 相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。 28 三种不同性质蛋白质的电泳比较 Molecular Weight pI Native PAGE SDS- PAGE Mobility Protein Quaternary Structure X Y Z Tetramer(40,000)x4 Monomer88,000 Monomer60,000 5.8 5.2 9.3 Fast Slow Medium Slow Upward Fast X YZ - -+ 29 单元体分子量的测定 ： SDS-PAGE 0.5 1.0 kD 330 220 6

11、7 60 36 18.5 kD 94 67 43 30 20.1 14.4 Mol mass kD 300 200 100 80 60 50 40 30 20 10 Migration (Rf) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis 30 电泳原理 指带电粒子在电场中朝与自身带相 反电荷的电极移动的现象 CATHODE ANODE +- - + 31 带电颗粒 小离子：Cl-, 甘氨酸离子 生物大分子：蛋白质、核酸等 蛋白质分子是由氨基酸组成的， 而氨基酸带有可解离的氨基和羧基， 是典型的两性电解质，在一定的pH 条件下就会解离而带电

12、 32 Pierce 商品供应预铸胶片 梯度或固定浓度胶体 10, 12. 15 样本槽 中性 pH 缓冲液 拋弃式塑料外壳 胶体 1 mm 厚度 33 不连续凝胶电泳系统组成 1 电泳系统pH胶体浓度缓冲液 上层(负极) 缓冲液 2 样本溶液 3 浓缩层胶体 6.8 4 分离层胶体 胶 体 5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-HCl Tris-HCl Tris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 胶体不连续性有浓缩样品的作用 34 样品分子量的确定 M为蛋白质分子量、m相对迁移率、b为斜率、K 为截距。 一定条件下K和b为常数，根据迁移率可求得分子 量。 lgMw=b*mR+K 蛋白质分子量在蛋白质分子量在15000-200000之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移 率与分子量的对手呈线性关系：率与分子量的对手呈线性关系： 35 三种不同性质蛋白