牡丹种子中分离的两种新型茋类物质顺式和反式suffruticosol D的体外抗肿瘤作用-翻译

1、International Journal of Oncology, 2015, IF=3.018In vitro antitumor effects of two novel oligostilbenes, cis- and trans-suffruticosol D, isolated from Paeonia suffruticosa seeds从牡丹种子中分离的两种新型茋类物质:顺式和反式suffruticosol D的体外抗肿瘤作用Nadin Marwan Almosnid, Ying Gao, Chunnian He, Hyo Sim Park and Elliot Altman摘

2、要：天然衍生的茋类成分已被证明具有细胞毒性，有抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的生物活性。之前的植物化学研究表明牡丹的种子富含天然茋。本研究证明了从牡丹种子中分离的茋类成分：顺式和反式suffruticosol D的抗肿瘤作用，并检验了作用机制。 顺式和反式suffruticosol D表现出对人类肿瘤细胞系A549（肺）、BT20（乳腺）、MCF-7（乳腺）和U2OS（骨肉瘤）显著的细胞毒性，但对正常人类细胞系HMEC（乳腺）和HPL1A（肺）表现出显著较低的毒性。我们还发现，顺式和反式suffruticosol D通过激发氧化应激，促进细胞凋亡，降低线粒体膜电位，抑制细胞运动性，并且

3、阻断人肺癌细胞中的NF-B途径发挥其抗肿瘤作用。此外，我们评估了各自的生物效力，发现反式suffruticosol D比顺式suffruticosol D更有效。总的来说我们的结果表明顺式和反式suffruticosol D可能是对癌症更有希望的化疗剂。引言目前的癌症药物昂贵，且往往造成严重的副作用。美国国家癌症研究所开始在20世纪60年代开始研究抗肿瘤植物提取物，前提是从治疗植物中获得的天然化合物可能产生抗癌药物，从此以后一直有很大的研究兴趣。中药（TCMs）用晒干的植物或植物提取物为年的实验和临床研究提供了低成本的，成千上万的饮食和药物治疗已证明，中药中使用的超过400种植物对于各种癌症的

4、预防或治疗是有效的抗癌药物（1-4）。然而，为确定中药中单体化合物的有效性，仍有许多工作要做。牡丹，是芍药属中一种广泛应用的药用植物。本属包括大约35种，分为三组：北美芍药组，芍药组，和牡丹组（5）。中国药典已经记录了牡丹根（根皮）作为重要的中药来源（6）。牡丹提取物具有细胞毒性、抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性（5）。之前对牡丹的光化学研究确定了超过260种生物活性化合物，包括酚类、单萜酰葡萄糖苷、芍药醇、类黄酮、单宁、类固醇、三萜类化合物和茋类化合物（7）。最近的一项研究表明，牡丹的种子含有与其他化合物相比的大量茋类物质（7,8）。茋类物质是一类植物中广泛存在的1，2二苯基乙烯核多酚（9）。由于其

5、抗肿瘤、抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗疟疾和抗炎生物活性，茋类化合物引起了极大的兴趣（10-16）。茋类物中一个熟知的例子是白藜芦醇，并且其抗肿瘤活性已被深入研究。几个体内和体外研究表明，白藜芦醇抑制癌细胞的生长和与影响癌症发展有关的各种分子靶点，如Wnt信号通路，核因子B（NF-B）和MAPK / ERK通路在不同类型的癌症（17,18）。首先，两个新的茋类物质顺式和反式suffruticosol D是从牡丹种子中提取的（5）。这两种化学物质具有类似的结构，因为反式suffruticosol D的质量碎裂模式非常类似于顺式suffruticosol D，顺式suffruticosol D与反式

6、suffruticosol D仅是烯烃氢信号不同（图1）。本研究中，我们研究了顺式和反式suffruticosol D的抗肿瘤活性，并研究这两种化学物作用于体外癌细胞的机制。一、 材料和方法：1. 化合物分离：牡丹的种子在中国安徽的铜陵收集，并确定在2012年9月一个凭证标本（2012001）已存入种子资源库在药用植物研究所，中国医学科学院和北京联合医学院。如先前所描述的顺式和反式suffruticosol D的从牡丹干种子中萃取和分离（5）。将化合物以10mM（mmol/L）的浓度回溶于二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州，圣路易斯）中并4下冷藏。2. 细胞培

7、养：包括A549（肺癌），BT20（雌激素受体阴性人乳腺癌），MCF-7（雌激素受体阳性人乳腺癌）和U2OS（人骨肉瘤）的四种人癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心（美国维吉尼亚州，马纳萨斯）。稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的A549细胞系购自Cell BioLabs公司（圣地亚哥，美国加利福尼亚州）。A549、A549-GFP和BT20细胞在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich）中培养，MCF-7细胞在DMEM培养基（ATCC）中培养，U20S细胞在McCoys 5A培养基（ATCC）中培养。作为对照，从名古屋大学获得HPL1A细胞（人外周肺上皮细胞），并在DMEM/F12培养

8、基（Sigma-Aldrich）中培养; HMEC细胞（原代人乳腺乳腺上皮细胞）购自ATCC并在McCoys 5A培养基中培养。从日本名古屋大学获得HPL1A细胞（原代人外周肺上皮细胞），在DMEM/F-12K培养基（Sigma-Aldrich）中培养。 所有培养基含有10FBS（Sigma Aldrich）和1链霉素和青霉素（Sigma-Aldrich）。将这些细胞在37、5CO2的潮湿环境中培养。3. 细胞增殖测定：使用刃天青还原试剂AlamarBlue（Invitrogen公司，美国马里兰州，弗雷德里克）评价化合物的细胞毒性。将细胞以每孔5103个细胞的密度接种在含有100l培养基的96

9、孔微量培养板中，预处理16小时。接下来，用含有320、100、32、10、3.2、1.0和0.32M七种不同浓度的顺式或反式suffruticosol D的培养基代替之前的培养基。用1DMSO作载体对照。将细胞置于37的培养箱中48小时。用含有仅用载体处理过的细胞的培养基作阴性对照。随后，将AlamarBlue溶液加入到培养基中，并将细胞在CO2培养箱中恒温培育1小时。使用酶标仪（Molecular Devices公司，美国加利福尼亚州，Sunnyvale）在Ex 555nm和Em 590nm处测量染料的荧光强度变化。使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software公司

10、，美国加利福尼亚州，La Jolla）通过IC50测定抑制细胞生长50的浓度来测定细胞毒性。对于N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）衰减测定，用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理细胞培养48小时后（可加10mM NAC（Sigma-Aldrich），使用AlamarBlue测定法评估细胞存活力。4. 细胞凋亡检测：根据制造商的说明书，使用FlowCellect Annexin Red试剂盒（EMD Millipore公司，美国麻萨诸塞，Billerica）测定A549细胞中的凋亡率。将A549细胞接种在96孔板中。用100、32和10M浓度的顺式或反式suffruticoso

11、l D处理24小时后，收集浮动和附着的细胞用于分析。将细胞在700xg的离心力下离心7分钟，并回溶于100l缓冲液（EMD Millipore）。然后，细胞用膜联蛋白染色15分钟，用7-氨基-放线菌素D（7-AAD）染色5分钟，用Guava EasyCyte流式细胞仪（EMD Millipore）检测。用Guava InCyte软件分析数据。5. 凋亡抗体阵列：根据制造商的说明书，使用人细胞凋亡抗体阵列试剂盒（RayBiotech，Inc.，美国加利福尼亚，Norcross）评估凋亡蛋白表达。将A549细胞以每孔8,000个细胞的强度接种在96孔板中，然后用50M浓度的顺式或反式suffrut

12、icosol D处理6小时。将细胞在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中裂解。使用蛋白质浓缩柱（EMD Millipore）将细胞裂解物浓缩至总蛋白质浓度为2mg/ml。然后将样品用缓冲液稀释10倍，并在阵列膜上在室温下恒温培养2小时，并用洗涤缓冲液洗涤5次。随后将与生物素结合的抗体混合物的混合物加入膜中并在4培养过夜。然后将样品与HRP结合的链霉亲和素在室温下培养2小时，并使用化学发光底物检测信号。使用Image Studio软件（LI-COR Biotechnology，美国内布拉斯加州，Lincoln）定量每个阵列点的强度，然后归一化为内部对照。6. 氧化应激测定：使用Hitkit氧化应激试剂

13、盒（Thermo Scientific，美国MA，Waltham）测定活性氧（ROS）的产生。简言之，将A549细胞用顺式或反式suffruticosol D处理24小时，用温的37甲醛固定，并用Hoechst和二氢乙锭（DHE）染料在37、5CO 2下染色30分钟。将1M浓度的阿霉素（DOX）用作阳性对照，将仅用媒介物处理的细胞用作阴性对照。细胞核中的ROS（活性氧）生成通过产生溴化乙锭荧光来指示，并且通过使用ArrayScan VTI Highcontent筛选（HCS）读数器（Thermo Scientific）测量核荧光强度来评估。 获取图像，并通过vHCS扫描软件分析数据。7. 细胞

14、运动性测定：以如下方法用蓝色荧光珠（Life Technologies，美国OR，Eugene）涂覆96孔胶原板（Corning，美国NY，Corning）。将珠子以14000g离心1分钟，用PBS洗涤两次，然后将75l珠子嵌入96孔胶原板的每个孔中，并在37下培养1小时。在含有10FBS的培养基中用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理细胞18小时之后。用PBS洗涤板5次，将A549-GFP细胞以500个细胞/孔接种在包被的板中，并在37温育1小时。用无血清培养基处理的细胞用作阴性对照，用含有10FBS的培养基处理的细胞用作阳性对照。使用Arrayscan VTI HCS读数

15、器（Thermo Scientific）对细胞轨道成像，并且通过vHCS扫描软件分析数据。计算测试化合物和对照的每个细胞的完整轨迹面积的平均值。8.多参数细胞毒性试验：使用HCS分析来测量核形态，细胞膜的通透性，以及线粒体膜电位变化，细胞毒性相关联的三个参数。A549细胞以不同浓度的顺式或反式suffruticosol D24处理小时。然后将细胞固定并用含有Hoechst染料，膜通透性染料和线粒体膜电位染料（Thermo Scientific）的温热溶液染色。使用Arrayscan VTI HCS读数器（Thermo Scientific）对细胞成像。 收集核大小，细胞渗透性和线粒体膜电位的数

16、据，并使用vHCS扫描软件进行分析。9.蛋白质印迹分析：A549细胞用50M的顺式或反式suffruticosol D处理3小时，然后与10ng/ml的TNF-培育30分钟。将用NF-B抑制剂Bay11-7082（10M）（Sigma-Aldrich）处理的细胞用作阳性对照，将仅用媒介物处理的细胞用作阴性对照。处理后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂（Thermo Scientific）裂解细胞，并在4下以13,000rpm离心5分钟。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。在4-2

17、0Tris-甘氨酸凝胶（Thermo Scientific）上分离蛋白质，并电泳转移至PVDF膜。以下使用的主要抗体：phosphorylated-NF-Bp65、NF-Bp65（Cell Signaling Technology公司，美国MA，Danver）和肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology公司，美国德克萨斯州，Dallas）。在4下将膜与初级抗体以1：1000的浓度培养过夜。用1X PBS洗涤5次后，将膜在室温下与HRP结合的anti-rabbit IgG二抗孵育2小时。膜用化学发光底物（Thermo Scientific）显影，并用chemiDoc MP成像系统

18、（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州，Hercules）扫描。10.NF-B核易位测定：多重NF-B活化HCS试剂盒（Thermo Scientific）用于评估NF-B核易位。用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D A549细胞预处理4小时，然后将10ng/ml 的TNF-（Sigma-Aldrich公司）加入到细胞处理30分钟。处理后，在检测前将细胞固定并透化。通过加入NF-Bp65初级抗体，然后用与DyLight 549和Hoechst染料（Thermo Scientific）偶联的第二抗体染色来检测NF-B分布。用仅含载体的培养基处理的细胞用作阴性对照，用25ng /

19、ml TNF-处理的细胞用作阳性对照。使用Arrayscan VTI HCS读数器使细胞成像。收集核和细胞质区域之间的NF-B荧光强度平均差异的数据，并通过vHCS扫描软件进行分析。二、 结论1. 顺式和反式suffruticosol D在肺癌，乳腺癌，和骨癌细胞的细胞毒性在48小时处理后，顺式和反式suffruticosol D对A549（肺），BT20（乳腺），MCF-7（乳腺）和U2OS（骨肉瘤）癌细胞系显示出显著的细胞毒性作用。suffruticosol D对这些癌细胞的IC 50值为9.93至46.79M，如表I所示。有趣的是，我们观察到反式suffruticosol D（9.93-

20、15.84M）比顺式suffruticosol D（13.42M-46.79M）的IC 50值低。此外，顺式和反式suffruticosol D对正常乳腺上皮细胞HMEC（IC50值分别为146.3和269.5M）和正常肺上皮细胞HPL1A（IC 50值分别为78.3和177.5M）均显示出较弱的细胞毒性（表I）。表1：顺反式suffruticosol D处理的癌细胞和正常细胞系的IC 50值用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理细胞48小时，并用AlamarBlue染料评价细胞的存活力。 数据为平均值标准差，并且重复实验3次。2. 顺式和反式suffruticosol D诱

21、导A549肺癌细胞凋亡为了找出这些细胞凋亡是否是由于细胞毒性，我们使用用顺式或反式suffruticosol D处理的A549细胞进行凋亡测定。在24小时处理后，与未处理的细胞相比，两种化合物在宽范围的浓度下显示出显著的凋亡诱导（*P 0.05，*P 0.01或*P 0.001），并且凋亡效应是浓度依赖性的（图2，A-D）。反式suffruticosol D在10,32和100M的浓度下分别诱导30.1、39.8和41.9的A549细胞凋亡。顺式suffruticosol D在10、32和100M的浓度下分别诱导22.2、27.1和45.3的A549细胞凋亡。接着，我们用细胞凋亡蛋白质阵列来分

22、析和确定顺式和反式suffruticosol D对细胞凋亡蛋白质的影响。凋亡抑制蛋白家族（IAP）中的两种，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和存活蛋白以及热休克蛋白Hsp60和Hsp70，在用顺式和反式suffruticosol D处理后表现出显著的下降（图2，E）。反之，死亡受体6（DR6），也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员21（TNFRSF21）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B（p27）和BH3 interacting-domain死亡激动剂（BID），这些在顺式和反式suffruticosol D处理后均有上升（图2，F）。图2.通过顺式和反式suffruticosol D诱导A549

23、细胞凋亡。在用顺式或反式suffruticosol D处理24小时后，用Annexin V/7-AAD对A549细胞染色，并通过流式细胞术评估凋亡细胞的百分比。仅用载体处理的细胞作阴性对照。（A-C）用各种浓度的顺式或反式suffruticosol D处理的A549细胞的膜联蛋白V/7-AAD双染色。（D）通过顺式或反式suffruticosol D诱导的凋亡细胞的百分比。（E、F）顺式或反式suffruticosol D对凋亡的关键调节蛋白的影响。误差线表示来自三次实验的标准偏差。 *P0.05; *P0.01; *P0.001。3. 顺式和反式suffruticosol D诱导A549肺癌

24、细胞中ROS的产生我们检查了A549细胞中的细胞ROS水平，以确定顺式和反式suffruticosol D是否诱导氧化应激。如图3A所示，顺式和反式suffruticosol D都将非荧光DHE转化为与DNA结合的荧光乙锭，表明它们在A549细胞中诱导ROS产生。定量数据显示两种化合物以浓度依赖性方式显着诱导ROS产生（*P0.01，*P0.001或*P0.0001）。处理24 h后，反式suffruticosol D在10、32和100M浓度下将ROS水平提升32.8、34.6和87.2，而在A549细胞中浓度为10、32和100M时，顺式suffruticosol D使ROS水平分别提升3

25、2.8、55.6和73.1（图3，B）。为进一步验证ROS水平是否与顺式和反式suffruticosol D诱导的细胞毒性相关联，我们用抗氧化剂的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和不同浓度的顺式或反式suffruticosol D共同处理A549细胞48小时。我们观察到，在所有测试的浓度下，10mM的NAC都减轻了在A549细胞中由顺式或反式suffruticosol D诱导的细胞死亡（图3，C）图3.在顺式和反式suffruticosol D诱导的A549细胞中的氧化应激。A549细胞用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理24小时，然后用Hoechst和DHE染料染色。用d

26、oxorubicin（阿霉素）处理的细胞用作阳性对照，用仅用载体处理的细胞作阴性对照。通过转化为溴化乙锭的DHE的荧光强度测量ROS水平。（A）HCS阅读器的荧光细胞图像。比例尺，100m。（B）在用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D的处理的A549细胞ROS水平（C）抗氧化NAC减少了由顺式或反式suffruticosol D导致的A549细胞的死亡。误差线表示来自三个实验的标准偏差。*P0.05; *P0.01; *P0.001。4. 顺式和反式suffruticosol D抑制A549肺癌细胞的运动性 为了测试顺式和反式suffruticosol D是否影响癌细胞运动性，

27、我们测量治疗后迁移细胞产生的轨迹的大小，其与细胞运动的大小成比例。如图4A所示，在含血清的培养基中用顺式或反式地曲唑D处理的A549细胞表现出较小的运动活性，由每个细胞的轨迹面积比未处理的细胞更小。所有浓度顺式和反式suffruticosol D在A549细胞测试中都显著抑制细胞运动（*P0.001或*P0.0001）（图4，B）。反式suffruticosol D在10、32和100M的浓度下分别将A549细胞运动性降低了40.7、40.7和54.9，而顺式suffruticosol D在10、32和100M的浓度下分别将A549细胞运动性降低了42.3、42.0和50.4。图4.在A549

28、细胞中顺式和反式suffruticosol D诱导的细胞运动性变化。将A549-GFP细胞接种在具有单层荧光珠的96孔板中。在用顺式或反式suffruticosol D处理18小时后，通过测量荧光轨迹面积评价个体细胞运动。用无血清培养基处理的细胞作为阴性对照，用含有10血清的培养基处理的细胞作为阳性对照。（A）显示细胞运动的荧光轨迹区。比例尺，200m。（B）测量用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理的细胞的细胞轨道区域。误差线表示来自三个实验的标准偏差。*P0.05; *P0.01; *P0.001。5. 顺式和反式suffruticosol D降低A549细胞中线粒体的膜

29、电位为了确定顺式和反式suffruticosol D在人肺癌细胞中的细胞毒性作用，我们使用HCS读数器测量了三种细胞健康参数，核形态、细胞膜通透性和线粒体膜电位变化。如图5所示，在线粒体电位通道中，未处理的A549细胞显示出明亮的荧光强度，表明完整的线粒体膜。相比之下，在用顺式或反式suffruticosol D处理的细胞中，染料的荧光强度在所有测试浓度下显着降低，这表明顺式和反式suffruticosol D处理的A549细胞中线粒体膜电位的显著降低（*P0.001）。我们还观察到高浓度（100M）反式suffruticosol D处理的细胞的细胞核收缩、细胞膜通透性增加（*P0.05或*P

30、0.01）。然而，在用顺式suffruticosol D处理的细胞中，在核大小和细胞膜通透性方面没有检测到显着变化。图5. 顺式和反式suffruticosol D处理的A549细胞中的多参数细胞毒性。 A549细胞用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理24小时，然后用三种染料同时染色（Hoechst染料，细胞渗透性染料和线粒体膜电位染料）。用载体处理的细胞仅用作阴性对照，用10M缬氨霉素处理的细胞用作阳性对照。（A）通过HCS阅读器的荧光细胞图像。比例尺，100m。（B-D）用顺式或反式suffruticosol D处理的细胞的核大小、细胞通透性和线粒体膜电位的评价。误差线

31、表示来自三次实验的标准偏差。*P0.05; *P0.01; *P0.001。6. 顺式和反式suffruticosol D抑制TNF-诱导的NF-B活化：我们通过免疫印迹分析来检验顺式和反式suffruticosol D对NF-B在A549细胞中表达的影响。如图6A所示，在TNF-刺激后，检测到磷酸化NF-Bp65的过表达，并且过表达被顺式和反式suffruticosol D显著抑制。在反式suffruticosol D-处理的细胞中，磷酸化NF-kB的p65的表达几乎被完全阻断，而在顺式suffruticosol D处理的细胞中，磷酸化的NF-Bp65的表达被阻断，与Bay11-7082抑制

32、剂对照引起的阻断一样。接下来，我们使用HCS分析来测试顺式或反式suffruticosol D是否能阻断A549细胞中的NF-B核易位。如图6B所示，NF-B荧光染色保留在细胞质区域，在未处理细胞的核区域中没有检测到荧光，在用TNF-处理的细胞中，在核区域中检测到NF-B荧光染色，表明NF-B从细胞质转移到细胞核。在用顺式或反式suffruticosol D处理的A549细胞中，NF-B荧光染色保留在细胞质中，这表明NF-B向细胞核的易位被阻断。在所有测试浓度反式suffruticosol D处理下都显著抑制NF-B活化水平（*P0.001）（图6C）。相比之下，仅在使用100M顺式suffr

33、uticosol D处理中显着抑制了NF-B的活化（*P0.001）。图6. 顺式和反式suffruticosol D抑制A549细胞中NF-B的转运A549细胞用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理4小时，然后用25ng / ml TNF-刺激30分钟。用单独的TNF-或载体处理的细胞仅用作对照。通过测量NF-B易位指数确定细胞核和细胞质之间的荧光强度差异。（A）磷酸化NF-Bp65和总NF-Bp65的表达的Western印迹分析。（B）HCS阅读器的荧光细胞图像。比例尺，100m。（C）A549细胞中NF-B易位指数的评价。误差线表示来自三次实验的标准偏差。*P0.05;

34、 *P0.01; *P0.001。三、 讨论与结论茋类物质已经被广泛认为可作为抗肿瘤的药物来源。先前已从牡丹种子中提取了两种新型茋类物：顺式和反式suffruticosol D，但其抗肿瘤活性未被确定。本研究发现这两种茋类物对几种类型的癌细胞系表现出了显著的抗肿瘤活性，并研究了其细胞毒性作用及其机制。在被测试的所有癌细胞系中，反式suffruticosol D（9.93-20.8M）表现出比顺式suffruticosol D（13.42-46.79M）更低的IC50值，这表明反式suffruticosol D比顺式suffruticosol D异构体的细胞毒性更强。同时，就三个细胞毒性参数（核

35、大小、细胞膜通透性和线粒体跨膜电位的变化的影响）而言，反式suffruticosol D比顺式suffruticosol D更强。在NF-B活化活性方面，反式suffruticosol D也比顺式suffruticosol D显示出更高的抑制作用，这与前人的研究结果一致，说明反式suffruticosol D比顺式suffruticosol D异构体19 具有更强的细胞毒性。此外，这两种化合物表现出对肿瘤细胞系的选择性细胞毒性比正常细胞系更强。癌细胞通常有逃避细胞凋亡（程序性细胞死亡）的能力，这是保持人体细胞群的一种稳态机制（20）。因此，靶向诱导细胞凋亡已成为抗癌治疗的重要策略。众所周知，凋

36、亡途径有两种，外源性途径（死亡受体途径），以及内源性线粒体途径（线粒体途径）。有研究表明，线粒体在细胞凋亡中，特别是在内源性凋亡途径中起关键作用21,22。 线粒体是细胞内ROS的主要来源，并且ROS产生的增加可损伤线粒体膜，并随后导致促凋亡蛋白和细胞色素c的释放，从而激活凋亡途径23-25。在本研究中，我们发现顺式和反式suffruticosol D在24 h处理后以浓度依赖的方式诱导A549肺癌细胞凋亡。两种suffruticosol D都显着降低了肺癌细胞中的线粒体膜电位，表明它们可能诱导线粒体凋亡途径。因为这两种化合物显著提高肺癌细胞中细胞ROS水平及其由NAC衰减测定法表现出的与RO

37、S水平相关的细胞毒性，可以推测顺式和反式suffruticosol D诱发的过量ROS通过损伤线粒体膜作为凋亡介质，引起线粒体内容物的释放，最终导致细胞凋亡。此外，顺式和反式suffruticosol D影响了参与凋亡的几个关键调节剂的表达，XIAP、存活蛋白、Hsp60和Hsp70下调，而BID、DR6和p27上调。XIAP和存活蛋白是已知的凋亡抑制剂，其通过抑制胱天蛋白酶-3、-7和-9来预防凋亡（26-28）。已经证明XIAP或存活蛋白的下调抑制癌症的发展并且提高癌细胞对化学试剂的敏感度（29-32）。热休克蛋白Hsp60和Hsp70是伴侣，它们在肿瘤细胞存活和增殖中起重要作用，这是由于

38、它们阻断内源和外源凋亡途径的能力（33、34）。BID是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员，并且是由胱天蛋白酶-8诱导的线粒体损伤的介质（35）。p27，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，通过阻止细胞周期蛋白E-Cdk2或细胞周期蛋白D1-Cdk4复合物的激活控制G1的细胞周期进程（36、37）。DR6，也被称为TNFRSF21，是死亡受体家族中的一员，其在哺乳动物细胞中诱导凋亡，其凋亡功能由存活蛋白的抑制（38）。顺式和反式suffruticosol D诱导的XIAP，存活蛋白、Hsp60和Hsp70的下调以及BID、DR6和p27上调至少部分地有助于顺式和反式suffruticosol D的细胞凋

39、亡作用。癌细胞具有通过肌动蛋白细胞骨架的重组而迁移到周围组织和器官的能力（39、40）。癌细胞的大部分死亡发生在细胞从它们起源的初始器官移动时（41）。因此，癌细胞运动和转移的控制是癌症治疗中的十分重要的一个问题，代表了潜在肿瘤治疗的新机会（42）。顺式和反式suffruticosol D在所有测试浓度处理18小时后显著抑制肺癌细胞的移动性。因此，两种化合物都表现出作为癌细胞迁移抑制剂的治疗潜力。已知NF-B途径控制细胞生长和存活，并且已经发现转录因子NF-B在各种肿瘤中被永久激活（21）。癌细胞中NF-B的激活通常与耐药性相关，因为放射性和化学治疗都诱导NF-B途径的组成型激活（43）。因此

40、，化合物阻断NF-B通路的能力对于癌症治疗的疗效是重要的（44）。在这项研究中，我们评估顺式和反式地高辛D抑制肺癌细胞中抑制TNF-诱导的NF-B活化的能力。在4小时处理后，两种化学物质显着阻断NF-Bp65磷酸化以及NF-Bp65从细胞核转移到细胞质，这表明它们可能作为NF-B途径的抑制剂。由于NF-B影响许多抗凋亡蛋白的转录，包括凋亡蛋白（cIAP）的细胞抑制剂，XIAP、bcl-2、bcl-XL和FADD-like IL-1-转换酶抑制蛋白（c -FLIP），阻断NF-B核易位降低抗凋亡蛋白的表达，并随后促进凋亡。此外，一些研究已经表明ROS的增加可以通过抑制如TNF和IL-1等的细胞因

41、子阻断NF-B途径（45）。因为顺式和反式suffruticosol D能增加肺癌细胞中ROS的产生，NF-B途径中的阻断可能与诱导过量ROS抑制细胞因子相关。总之，这项研究证明，顺反式suffruticosol D具有抗肿瘤活性的发展前景。这两种化合物能够选择性地抑制各种癌细胞的生长，诱导A549肺癌细胞的凋亡，并抑制A549细胞运动。凋亡的诱导可能与ROS产生和NF-B途径的抑制相关。总的来说，我们的结果表明顺反式suffruticosol D的细胞毒性的潜在机制。如图7所示，在A549肺癌细胞中，顺式和反式suffruticosol D引发氧化应激，反过来导致线粒体损伤、阻断NF-B活化

42、并最终触发细胞凋亡。我们的研究结果表明，顺反式suffruticosol D也许能用于癌症的化学治疗。产考文献：1. Cai Y, Luo Q, Sun M and Corke H: Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Sci 74: 2157-2184, 2004.2. Zhang Q and Gong H: Clinical Practice of Anticancer Traditio

43、nal Chinese Medicines. Peoples Health Publishing House, Beijing, 1998.3. Bo QM, Wu ZY, Shun QS, Bao XS, Mao ZS, Ha SQ, Lu SY and Huang JM: A Selection of the Illustrated Chinese Anti-Cancer Herbal Medicines. Shanghai Science and Technology Literature Press, Shanghai, 2002.4. Parekh HS, Liu G and Wei

44、 MQ: A new dawn for the use of traditional Chinese medicine in cancer therapy. Mol Cancer 8: 21, 2009.5. He CN, Peng Y, Xu LJ, Liu ZA, Gu J, Zhong AG and Xiao PG: Three new oligostilbenes from the seeds of Paeonia suffruticosa. Chem Pharm Bull (Tokyo) 58: 843-847, 2010.6. Chinese Pharmacopoeia Commi

45、ssion: In: Chinese Pharmacopoeia. China Medical Scientific and Technological Press, Beijing, pp160161, 2010.7. He CN, Peng Y, Wu QL, Xiao W, Peng B, Wang Z and Xiao PG: Simultaneous determination of ten stilbenes in the seeds ofPaeonia species using HPLC-DAD. J Liquid Chromatogr Relat Technol 36: 17

46、08-1724, 2013.8. He CN, Peng Y, Zhang YC, Xu LJ, Gu J and Xiao PG: Phytochemical and biological studies of Paeoniaceae. Chem Biodivers 7: 805-838, 2010.9. Shen T, Xie CF, Wang XN and Lou HX: Stilbenoids. In: Natural Products. Springer, pp1901-1949, 2013.10. Cai T and Cai Y: cis-Ampelopsin E, a stilb

47、ene isolated from the seeds of Paeonia suffruticosa, inhibits lipopolysaccharidestimulated nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages via blockade of nuclear factor-kappa B signaling pathway. Biol Pharm Bull 34: 1501-1507, 2011.11. Yuk HJ, Ryu HW, Jeong SH, Curtis-Long MJ, Kim HJ, Wang Y, Song

48、 YH and Park KH: Profiling of neuraminidase inhibitory polyphenols from the seeds of Paeonia lactiflora. Food Chem Toxicol 55: 144-149, 2013.12. Hussain S, Slevin M, Ahmed N, West D, Choudhary MI, Naz H and Gaffney J: Stilbene glycosides are natural product inhibitors of FGF-2-induced angiogenesis.

49、BMC Cell Biol 10: 30, 2009.13. Simoni D, Invidiata FP, Eleopra M, Marchetti P, Rondanin R, Baruchello R, Grisolia G, Tripathi A, Kellogg GE, Durrant D,et al: Design, synthesis and biological evaluation of novel stilbene-based antitumor agents. Bioorg Med Chem 17: 512-522, 2009.14. He S, Lu Y, Jiang

50、L, Wu B, Zhang F and Pan Y: Preparative isolation and purification of antioxidative stilbene oligomers from Vitis chunganeniss using high-speed counter-current chromatography in stepwise elution mode. J Sep Sci 32: 2339-2345, 2009.15. Jung M, Park WH, Jung JC, Lim E, Lee Y, Oh S and Moon HI: Synthes

51、is, structural characterization and biological evaluation of novel stilbene derivatives as potential antimalarial agents. Chem Biol Drug Des 73: 346-354, 2009.16. Lee K, Lee JH, Ryu SY, Cho MH and Lee J: Stilbenes reduce Staphylococcus aureus hemolysis, biofilm formation, and virulence. Foodborne Pa

52、thog Dis 11: 710-717, 2014.17. Shukla Y and Singh R: Resveratrol and cellular mechanisms of cancer prevention. Ann NY Acad Sci 1215: 1-8, 2011.18. Whitlock NC and Baek SJ: The anticancer effects of resveratrol: Modulation of transcription factors. Nutr Cancer 64: 493 502, 2012.19. Pettit GR, Grealis

53、h MP, Jung MK, Hamel E, Pettit RK, Chapuis JC and Schmidt JM: Antineoplastic agents. 465. Structural modification of resveratrol: Sodium resverastatin phosphate. J Med Chem 45: 2534-2542, 2002.20. Kasibhatla S and Tseng B: Why target apoptosis in cancer treatment? Mol Cancer Ther 2: 573-580, 2003.21

54、. Cheah SC, Appleton DR, Lee ST, Lam ML, Hadi AHA and Mustafa MR: Panduratin A inhibits the growth of A549 cells through induction of apoptosis and inhibition of NF-kappaB translocation. Molecules 16: 2583-2598, 2011.22. Ly JD, Grubb DR and Lawen A: The mitochondrial membrane potential (m) in apopto

55、sis; an update. Apoptosis 8: 115-128, 2003.23. Kannan K and Jain SK: Oxidative stress and apoptosis. Pathophysiology 7: 153-163, 2000.24. Ozben T: Oxidative stress and apoptosis: Impact on cancer therapy. J Pharm Sci 96: 2181-2196, 2007.25. Sosa V, Molin T, Somoza R, Paciucci R, Kondoh H and LLeonar

56、t ME: Oxidative stress and cancer: An overview. Ageing Res Rev 12: 376-390, 2013.26. Suzuki Y, Nakabayashi Y, Nakata K, Reed JC and Takahashi R: X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) inhibits caspase-3 and -7 in distinct modes. J Biol Chem 276: 27058- 27063, 2001.27. Schimmer AD, Dalili S,

57、Batey RA and Riedl SJ: Targeting XIAP for the treatment of malignancy. Cell Death Differ 13: 179-188, 2006.28. Ryan BM, ODonovan N and Duffy MJ: Survivin: A new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev 35: 553-562, 2009.29. Hu Y, Cherton-Horvat G, Dragowska V, Baird S, Korneluk RG, Durkin JP

58、, Mayer LD and LaCasse EC: Antisense oligonucleotides targeting XIAP induce apoptosis and enhance chemotherapeutic activity against human lung cancer cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res 9: 2826-2836, 2003.30. He X, Khurana A, Maguire JL, Chien J and Shridhar V: HtrA1 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced cytotoxicity by targeting XIAP for degradation. Int J Cancer 130: 1029-1035, 2012.31. Oost TK, Sun C, Armstrong RC, Al-Assaad AS, Betz SF, Deckwerth TL, Din