实验12土壤微生物的分离及纯化

1、 实实 验验 十一十一 土壤微生物的分离及纯化土壤微生物的分离及纯化 目的要求目的要求 n初步掌握微生物的分离初步掌握微生物的分离纯化纯化和培养菌种的和培养菌种的 基本方法。基本方法。 n练习微生物接种、移植和培养的基本技术，练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。 n掌握微生物的鉴定技掌握微生物的鉴定技术。术。 实验原理实验原理 n自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研 究某种微生物的特性，首先须使该微生物处究某种微生物的特性，首先须使该微生物处 于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得于纯培养状态。从混杂的微生物群体中

2、获得 只含有某一株微生物的过程称为微生物的分只含有某一株微生物的过程称为微生物的分 离与纯化。离与纯化。 实验原理实验原理 n土壤是微生物生活的大本营，为了获得土壤是微生物生活的大本营，为了获得 某种微生物的纯培养，一般是根据该微某种微生物的纯培养，一般是根据该微 生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不 同，而供给它适宜的培养条件，或加入同，而供给它适宜的培养条件，或加入 某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微 生物，再用各种方法分离、纯化该微生生物，再用各种方法分离、纯化该微生 物，直至得到纯菌株。物，直至得到纯菌株。 稀释涂板法、

3、稀释混合平板法、划线分离 实验材料实验材料 n样品：样品：新鲜土壤。新鲜土壤。 n培养基：培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 n无菌水：无菌水：装有装有10mL无菌水三角瓶、装有无菌水三角瓶、装有9mL无无 菌水的试管。菌水的试管。 n其它：其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角刮子、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角刮子、 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。 实验步骤实验步骤 n稀释涂板法稀释涂板法 n稀释混合平板法（混菌法）稀释混合平板法（混菌法）

4、 n划线分离划线分离 n微生物的培养微生物的培养 n制平板：制平板： 每组有培养每组有培养 皿皿3付。付。 在无菌培养 皿底部注明 分离菌名、 稀释度、组 别、班级。 实验步骤1（微生物的分离稀释涂平板法） n制备土壤稀释液：制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范）无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤称取土壤1g，放入放入10mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为稀释即为稀释10 1的土壤悬液。 的土壤悬液。 2. 另取装有另取装有9mL无菌水试管无菌水试管3支，用记号笔编上支，用记号笔编上10 2、 、 10 3、 、10 4。取已稀释成 。取已稀释成10

5、1的土壤液，振荡后静止 的土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入土壤悬液加入10 2的无菌 的无菌 水的试管中，并在试管内水的试管中，并在试管内轻轻吹吸轻轻吹吸数次，使之充分混匀，数次，使之充分混匀， 即成即成10 2土壤稀释液。同法依次连续稀释至 土壤稀释液。同法依次连续稀释至10 4 土壤稀 土壤稀 释液。释液。 图图1 土壤稀释液的土壤稀释液的 制备和稀释液的取样制备和稀释液的取样 n吸取稀释液吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法吸取104土壤稀 释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 n涂板涂板 用刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平， 倒置于

6、恒温箱培养。 n计算出每克土壤中细菌的数量。计算出每克土壤中细菌的数量。 即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培 养皿接种液的稀释倍数即得。 n挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。 微生物的分离微生物的分离平板涂抹法平板涂抹法 实验程序2（微生物的分离混菌法） n制平板制平板 n吸取稀释液吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法吸取104土壤稀释液 0.1mL，加在空培养皿中。 n混菌混菌 水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混 匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒 温培养箱培养。 n计算出每克土壤中放线菌的数量。计算出每克土壤中放线菌的数量。 n挑取单个菌落，进行划线分离。

7、挑取单个菌落，进行划线分离。 实验程序3（微生物的分离平板划线法） n制成平板。制成平板。 n凝固后，用接种环取相应的菌液一环（凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10 1）在平板上划 ）在平板上划 线。线。 1.连续划线法：连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面将挑取有样品的接种环在平板培养基表面 作连续划线。完毕后，倒置于作连续划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。温室培养。 2.分区划线法：分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，环， 先在培养基的一边作第一次平行划线先在培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养条，再转动培养 皿约皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第 一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四 次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。 n挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯 化，最后得到纯培养。化，最后得到纯培养。 平板划线法 n制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀分