流式细胞术原理及临床应用

1、流式细胞术发展史 1930年年Caspersson和和Thorell开始致力于开始致力于细细 胞计数胞计数的研究的研究 1934年年Moldaven最早设想细胞检测自动化，最早设想细胞检测自动化， 用光电仪记录流过一根用光电仪记录流过一根毛细管毛细管的细胞的细胞 1940年年Coons提出结合提出结合荧光素荧光素的的抗体抗体去标记去标记 细胞内的特定蛋白细胞内的特定蛋白 1949年年Wallace Coulter申请了在申请了在悬液中计悬液中计 数粒子数粒子的方法的专利的方法的专利 1950年年Caspersson用显微用显微UV-VIS检测细胞检测细胞 流式细胞术发展史 1953年年Cros

2、lannd-Taylor应用应用分层鞘流分层鞘流原理，原理， 成功设计红细胞光学自动计数器成功设计红细胞光学自动计数器 1969年年Van Dilla及其同事在及其同事在Los Alamos, NM发明第一台发明第一台荧光荧光检测细胞计检测细胞计 1972年年Herzenberg研制出研制出细胞分选细胞分选器器 1975年年Kohler等提出等提出单克隆抗体单克隆抗体技术，为技术，为 细胞研究提供大量的特异免疫试剂细胞研究提供大量的特异免疫试剂 大量厂家不断生产流式细胞仪大量厂家不断生产流式细胞仪 流式细胞术发展史 目前国内主要流式细胞仪厂家：目前国内主要流式细胞仪厂家： Beckton Di

3、ckinson(BD)公司公司 BACKMAN COULTER公司公司 流式细胞仪构造 流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)的结构的结构 分五部分：分五部分： 流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统 激光光源及光束成形系统激光光源及光束成形系统 光学系统光学系统 信号检测与存贮、显示、分析系统信号检测与存贮、显示、分析系统 细胞分选及浓缩系统细胞分选及浓缩系统 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry，FCM) 图示如下页：图示如下页： 流式细胞仪构造模式图 流式细胞仪构造示意图 流动室与液流驱动系统 流动室流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相是仪器核

4、心部件，被测样品在此与激光相 交。交。 流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔， 供单个细胞通过。供单个细胞通过。 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体流体 动力学聚焦动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。，从而得到准确的细胞荧光信息。 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振 动。动。 流动室与液流驱动系统 激光光源及光束成形系统 目前台式机目前台式机FCM，大多采用氩离

5、子气体激，大多采用氩离子气体激 光器。光器。 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约焦，形成约2266m的光斑，这样激光能的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。量较强，以激发荧光染料。 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。使用十分方便。 激光光源及光束成形系统 光学系统 FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和的光学系统由若干组透镜、滤光片和 小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分

6、别送入到不同的电子测控器。别送入到不同的电子测控器。 主要光学原件：主要光学原件：滤光片滤光片(Filter) 长通滤片长通滤片 Long Pass Filter, LP 短通滤片短通滤片 Short Pass Filter, SP 带通滤片带通滤片 Band Pass Filter, BP 长通滤片 短通滤片 带通滤片 信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间空间360度立体角发射，产生度立体

7、角发射，产生散射光散射光和和荧光荧光 信号。信号。 以激发光光源波长以激发光光源波长488nm为例示意图：为例示意图： 荧光信号示意图 散射光信号 散射光信号不依赖任何样品的制备技术散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。（如染色），因此称为细胞的物理参数。 前向散射角前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞与细胞 的大小有关，在的大小有关，在FCM应用中，常取应用中，常取FSC作阈值，作阈值， 来排除样品中的各种碎片。来排除样品中的各种碎片。 侧向散射角侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正与激光束正 交交90度的散射光

8、信号，与细胞粒度及复杂程度度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度 正相关。正相关。 散射光信号波长与激光相同散射光信号波长与激光相同。 散射光信号示意图 Right Angle Light Detector a a Cell Complexity Forward Light Detector a a Cell Surface Area Incident Light Source 荧光信号 一种是一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的细胞自身在激光照射下发出微弱的 荧光信号，称荧光信号，称自发荧光自发荧光。 一种一种是是经过特异荧光素标记后经过特异荧光素标记后，受激发光，受激发光 照射得到的荧光信号

9、，通过对这类荧光信照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 号的检测和定量就能了解所研究细胞参数号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 的存在与定量。的存在与定量。 常用荧光染料 目前台式机目前台式机FCM配置配置 488nm激光管常用染料有激光管常用染料有 PI (Propidium Iodide) PE (Phycorey- thrin) FITC (Fluorescein Isothiocyanate) PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-CY5等等 633nm激光管常用染料有激光管常用染料有 APC APC-Cy FCM测量数据的存贮、显示和分析

10、 目前目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光所采用的都是多参数指标，荧光 参数标记物最多可达参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用个，数据的存贮采用 列表排队方式，可节省存贮空间。列表排队方式，可节省存贮空间。 数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数 据的显示常用以下几种方式：据的显示常用以下几种方式： 直方图直方图 散点图散点图 等高线图等高线图 密度图密度图 三维图三维图 直方图 直方图直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度， 单位是道数，可以是线性或对数坐标。单

11、位是道数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。纵坐标一般是细胞数。 散点图 散点图散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该坐标为该 细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。 等高线图和密度图 三维图 设门分析 可以通过设可以通过设“门门” (Gate)，分析、分，分析、分 选感兴趣的细胞。选感兴趣的细胞。 FCM的分辨率 分辨率是衡量分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常测量精度的指标，通常 用变异系数用变异系数CV表示。表示。 一般要求一般要求CV8，最好，最好CV15% DNA倍体分析：

12、倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊 断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和 生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细 胞的分析，意义尤为重要。胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析：增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT) 多发性骨髓瘤 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌非

13、整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 变的一个重要标志变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信 息息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可 能能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助 指标指标 细胞凋亡分析 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段 形态学检测形态学检测 Ladders实验实验 流式细胞术

14、检测流式细胞术检测 与凋亡相关的病理过程与凋亡相关的病理过程 HIV 自身免疫性疾病自身免疫性疾病 肿瘤肿瘤 细胞凋亡分析 细胞凋亡的主要指标细胞凋亡的主要指标 细胞内酶改变：细胞内酶改变：Caspase-3活化活化 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻， 但仍然保持膜的完整性：但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 细胞核细胞核DNA的断裂改变：的断裂改变：TUNNEL实验（实验（ APO-BRDU，APO-DIRECT） 凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白： Fas Bcl-2 细胞凋亡PI分析 PI - Fluorescence Events 调亡细

15、胞调亡细胞 正常正常G0/G1期细胞期细胞 细胞凋亡Active Caspases-3 细胞凋亡Caspases-3 细胞凋亡Annexin V 细胞凋亡Annexin V 细胞凋亡BrdU FCM的应用免疫学 淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数绝对计数 HIV的诊断与研究的诊断与研究 淋巴细胞淋巴细胞 CD4/CD8分析分析 CD4绝对计数绝对计数 T细胞活化细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 FCM的免疫学应用 免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化淋巴细胞和单核细胞

16、的活化 细胞因子的研究细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究树突状细胞的研究 HLA-B27检测检测 淋巴细胞亚群分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，使用特异的单克隆抗体，进行多色分析， 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可 以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的各淋巴细胞亚群的百分含量百分含量 淋巴细胞亚群的淋巴细胞亚群的绝对计数绝对计数 临床意义 了解在不同情况下体内免疫功能状态了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程

17、、预后探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病免疫系统疾病 免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测肿瘤病人化疗后免疫力检测 淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关 T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关 总总T和总和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫 性疾病性疾病 NK细胞细胞（CD

18、3- CD16+ 56+），行使免疫监），行使免疫监 控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感 染细胞的细胞毒性作用。染细胞的细胞毒性作用。 SimulTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒试剂盒 CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评：确定淋巴细胞门，评 估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门 内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 1/ 2a，阴性对照，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，：确定淋巴细胞的阴性界值， 评估实验的非特异染色评估实验的非特

19、异染色 CD3/CD19：分析：分析T淋巴细胞和淋巴细胞和B淋巴细胞淋巴细胞 CD3/CD4：分析：分析T辅助辅助/诱导细胞诱导细胞 CD3/CD8：分析：分析T抑制抑制/细胞毒性细胞细胞毒性细胞 CD3/CD16+56：分析：分析T淋巴细胞和淋巴细胞和NK细胞细胞 淋巴细胞双色分析 LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定，准确圈定 淋巴细胞门，并评估门的有效性淋巴细胞门，并评估门的有效性 淋巴细胞双色分析 AIDS病人T细胞亚群分析 FCM的应用血液病学 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病残留白血病 造血干细胞计数造血干细胞计数 PNHPNH诊断诊断 网织

20、红细胞分析网织红细胞分析 血小板分析血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化血小板活化 网织血小板分析网织血小板分析 FCM的应用分子生物学 分选细胞后进行分选细胞后进行FISH 分选细胞后进行分选细胞后进行PCR 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧 光原位杂交（光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液）结合测定血液 CD4细胞中细胞中HIV特异的特异的DNA或或RNA 流式荧光原位杂交（流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定）测定 染色体端粒长度染色体端粒长度 性别选择 本实验室流式细胞仪及应用介绍 生产厂家：美国生产厂

21、家：美国BECTON DICKINSON(BD)公司公司 型号：型号：FACSCalibur 激光器：激光器：488nm和和633nm各一个各一个 荧光通道（共荧光通道（共4通道通道6参数）参数） FSC及及SSC：480-495nm FL1：515-545nm FL2：564-606nm FL3：670nm FL4：653-667nm 技术参数技术参数 分析速度分析速度10000个个/秒，分选速度秒，分选速度700个个/秒。秒。 常用荧光染料光谱学特征常用荧光染料光谱学特征 细胞周期分析PI单染 细胞周期分析PI单染 细胞周期分析ModiFit 分析 细胞周期分析ModiFit 分析 大鼠生

22、精细胞分析PI单染 细胞凋亡PI加Annexin V双染双染 FITC-Annexin V PI 淋巴细胞亚群分析 CY5.5-CD3 FITC-CD4 PE-CD8 培养细胞表面粘附分子表达 培养细胞表面粘附分子表达 FCM样品来源 需要制备细胞悬液需要制备细胞悬液 血液、体液等液体样品血液、体液等液体样品 培养的细胞培养的细胞 活体组织样品活体组织样品 冰冻组织冰冻组织 固定的组织样品固定的组织样品 直接应用直接应用 分离后使用分离后使用 样品制备 细胞分离方法细胞分离方法 直接离心沉淀直接离心沉淀 物理方法分离（超声波、筛网等）物理方法分离（超声波、筛网等） 酶消化酶消化 如果是固定的组

23、织，先脱蜡，再用物理或化如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化 学方法分离学方法分离 样品染色步骤 PBS洗细胞洗细胞12次次 加（荧光）单抗，暗处孵育加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟分钟 如果必需，加荧光二抗，暗处孵育如果必需，加荧光二抗，暗处孵育1530 分钟分钟 PBS洗细胞一次洗细胞一次 过过300目尼龙网目尼龙网 上机检测上机检测 PI单染测细胞凋亡步骤 制备细胞悬液制备细胞悬液 PBS洗细胞洗细胞1次，次，1000rpm离心离心10min，去，去 上清。上清。 加加PI染液（含染液（含PI 50mg/ml, Rnase 50ug/ml)， 暗处孵育暗处孵育30分钟分钟 过过300目尼龙网目尼龙网 上机检测上机检测 淋巴细胞亚群分析实验淋巴细胞亚群分析实验步骤 采集血液样品采集血液样品 取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体 20l至至Eppendorf管，加血样管，加血样50l，混匀后避，混匀后避 光保存光保存20