基因编辑技术

1、基因编辑技术 产生背景 定义及原理 分类及比较 CRISPR的优点及在植物育种上的应用 CRISPR基因编辑技术的一般操作程序 全基因组测序技术的不断发展和完善 大型基因组注释项目的实现 基因革命（基础科学与个 性化医疗之间进行转化） 将大量数据转化为功 能和临床相关知识 解决这个问题最核心的是需要有高效、可靠的 方法使研究者能够知道基因型如何影响表型 利用同源重组机制对基因进行定向失 活是为基因功能评估提供信息的有力 手段。但是这一技术的应用有几个限 制因素，包括遗传工程组件插入目标 位点的效率低、筛选过程费时费力、 有可能产生不利的突变效应等。 RNAi基因靶向敲除技术给研究者提供了快捷、

2、 廉价而且可以开展高通量研究的新方法，但 是， RNAi的基因敲除效果还不够彻底，每次 试验以及每个实验室的试验结果都会有差异， 另外还存在不可预知的脱靶情况，所以只能 够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中。 基因编辑技术（近十年出现）:可以帮助科研人员对各种细胞 和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering 一、基因编辑技术的产生背景一、基因编辑技术的产生背景 2014年3月12日，宾夕法尼亚大学Pablo Tebas教授团队在新英格兰医学 杂志撰文称，他们利用Sang

3、amo BioSciences开发的ZFNs基因编辑技术， 显著提高了艾滋病患者对艾滋病毒的抵抗能力。 1、在不同人种之间，自由在不同人种之间，自由“切换切换” 基因编辑技术首次应用于临床。目前Sangamo BioSciences基于ZFNs技术治疗 艾滋病的方法已经进入临床II期试验。 免疫细胞表面的CCR5蛋白 是HIV进入免疫细胞的“入 口”。而少数北欧人由于 CCR5基因“变异”（来源 于原始高加索人），具备 天然的HIV抵抗力。 “要不把患者的CCR5基因 都改成高加索人种那种类 型吧”！ 2、“关闭关闭”一个基因，打开生命之门一个基因，打开生命之门 2015年11月5日，Wase

4、em Qasim对外宣布，他们利用Cellectis公司经TALENs基 因编辑技术改造的UCART19细胞株，成功缓解了Layla的不治之症-急性淋巴细 胞性白血病（ALL），造就了世界首例婴儿白血病治疗奇迹，是基因编辑技术 有史以来第二次被运用在人体上技术。 修改捐赠细胞使其抗癌：修改捐赠细胞使其抗癌：蕾拉的生命获救得益于基因工程修改过的血液细胞。捐 赠的血液细胞来自美国，科学家总共对其进行了三次修改。科学家们首先在捐赠的 血液细胞中添加抗白血病基因，这些基因可编码靶向并杀死癌细胞的蛋白质，其次 科学家使用TALENs技术关闭两个基因，关闭第一个基因是为了确保捐赠的细胞不被 蕾拉的身体排斥

5、，关闭第二个基因是为了确保捐赠细胞不被治疗药物杀死。 http:/ http:/ 3、“恢复恢复”受损基因，才能重见光明受损基因，才能重见光明 2015年11月3日，Katrine Bosley在剑桥大学召开的EmTech大会上宣布，实验 室数据表明，CRISPR基因编辑技术可以用于治疗Leber congenital amaurosis （LCA；利伯先天性黑朦病，一种遗传性视力衰退疾病），Editas将在2017年 开展CRISPR基因编辑人体实验。 Editas宣布的2017年人体实验激动人心之处在于，这有可能是首次体内（in vivo） 基因编辑试验。这项研究成功的意义在于，将CRIS

6、PR基因编辑“工具”装载到 病毒体内，再把病毒注射到患处，CRISPR可以自行对患病部位进行基因改造。 那么以后治疗Layla那样的白血病，不用分离T细胞了，直接将改造好的病毒注 射到骨髓，就直接将基因异常的骨髓修复了，或者是直接整合目标基因加强其 战斗力。这样一来，很多大手术就会变成微创手术，带来的好处是难以估量的。 Editas的CEO Katrine Bosley 二、二、什么是基因组编辑技术什么是基因组编辑技术 所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列 进行删除和插入等操作，换句话说，基因 编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改 写DNA这本由脱氧核苷酸书写而成的生命之 书。 基因编辑技

7、术的原理基因编辑技术的原理 构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切 断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系修复系 统统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造 基因组的目的。 DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链 断裂（double-strand break, DSB）,即非同源末 端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和 同源重组（homologous recombination, HR）。 通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实 现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异 突变的引入和定点转基因 1）基因敲除）基因敲除：如果想使某个基因的功

8、能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生 DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。 2）特异突变引入：）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一 个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率 ，从而实现特异突变的引入。 3）定点转基因）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过 程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。 三、基因编辑技术的分类三、基因编辑技术的分类 第一代人工核酸内切酶：锌

9、指核酸内切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大 约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形 成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA 的双链切口。 第二代人工核酸内切酶：类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。 TALEN可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较 为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。201

10、2年， TALEN被科学杂志评为十大科学突破之一。 第三代人工核酸内切酶：规律间隔成簇短回文重复序列-Cas蛋白 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，主要是基于细菌的一种获得性免疫 系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。 图B：锌指核酸酶二聚体与 DNA结合示意图。 锌指核酸酶的靶序列含有两个锌指蛋白结合 位点，不过这两个位点之间还有一段57bp 的间隔序列，锌指核酸酶里的Fok I酶切结构 域就能够切割这段间隔序列。当然，我们也 可

11、以设计出只能够识别左侧或者右侧结合位 点的锌指蛋白。 ZFN： Cys2His2锌指蛋白 图A：一个锌指大约由30个氨基酸组成，形成了一种 保守的结构。在锌指螺旋结构表面的那几个氨基酸 能够与DNA大沟上的3个碱基结合，不过这种结合的选 择性会有所差异。 因为有了高度保守的链接序列，我们 就可以设计出能够识别918个碱基长度的DNA序列。在 一段 680亿个碱基组成的DNA序列里，18个碱基组成的 序列就足以成为一段特异性的序列，所以如果能够设计 出含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋白，那么 就意味着科学家们能够利用锌指蛋白识别出人类基因组 里的任意一段DNA序列。 TALE蛋白中的D

12、NA结合结构域是由一连串3335个氨基酸组成的重复结构域组 成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主 要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变 双氨基酸残基位点（repeat-variable di-residues, RVD）。 与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序 列。 TALEN分子比ZFN大得多，因此很难高效导入，科学家们也想出了不少的办 法，如金门分子克隆技术（Golden Gatemolecular cloning） 。 TALEN CRISPR/Cas系统系统 CRISPR/C

13、as 系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主 要依赖于crRNA 与Cas 蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以及 protospacer 根据CRISPR/Cas 系统这一特性，将其用于设计人工的核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，用来对我们感兴趣的基因位点进行修饰 三类 CRISPR/Cas 系统中Type型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和 tracrRNA 外，只有Cas9 一个蛋白目前，产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的Type型系统是被改造的最为成功的人工核酸内

14、切酶。 其基因座结构可分为三部分三部分：5 端为tracrRNA 基因，中间为一系列Cas 蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3 端为CRISPR 基因座， 由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺 序排列组成。 CRISPR/Cas的基因座结构的基因座结构 CRISPR/Cas的作用机理的作用机理（分为三个阶段来理解）： Phase Phase Phase 噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer 的5 或是3 端延伸几个碱基序 列很保守，被称为PAM(protos

15、pacer adjacent motifs)，它的长度一般为25碱基，一般与protospacer 相隔14 碱基新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM，将临近PAM 的序 列作为候选protospacer；然后在CRISPR 基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列 之间(图2)。目前只有第一个步骤被证实。 第一，CRISPR的高度可变间隔区的获得 第二，CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）：多个研 究表明CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在 Cas 蛋白或是核酸内

16、切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小 RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成， Type型 CRISPR/Cas系统crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNase参与以外，还需要 tracrRNA的指导 ； 第三，是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰：成熟的 crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描 到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外 源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割早期研究认为crRNA的 间隔序列(spacer)与外源DNA 的靶位点完

17、全互补配对对于切割是必需的，但 是后来的研究证明spacer 与protospacer 部分互补配对时切割也可以发生。 2013年 Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, Carlos F. Barbas. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 09 May 2013; DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004 CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较 功能结构功能结构： ZFNs、TAL

18、ENs人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合 蛋白与核酸内切酶Fok I融合而成，以二聚体形式发挥功能且只需要蛋白质 元件。序列特异性由每条多肽的DNA结合域决定，剪切由FokI酶结构域决 定。而CRISPR/Cas9系统由一个单体蛋白和一个嵌合的RNA构成，序列特异 性由gRNA中20个碱基序列决定，剪切由Cas9蛋白执行。 设计难度：设计难度：由于锌指蛋白与DNA互作的复杂性以及序列特异性的进一步限 制，一般认为ZFNs的设计比较困难， 成本昂贵，而且其专利被少数几家 商业公司控制。商业化的ZFNs较使用公共资源设计的ZFNs效果好，但是 贵得多(比如美国的Sangamo Biosci

19、ences（Richmond, CA, USA）公司 和美国SigmaAldrich（St. Louis, MO, USA）公司合作，开发出的一套 名为CompoZr的锌指蛋白构建系统）。 TALENs要更容易设计一些，因为 在蛋白质重复与DNA序列间有一对一的识别规则，而且高效的DNA组装技 术，如Golden Gate克隆，简化了TALENs元件的组装，然而TALENs基于的 高度重复序列会促使体内发生同源重组。目前也出现了商业化的人工 TALEN文库，比如法国巴黎的Cellectis Bioresearch公司（一个未经验证的定 制TALEN的价格是3360美元，验证过的是5000美元）

20、、美国的 Transposagen Biopharmaceuticals公司（Lexington, KY, USA）和生命科技公 司（Life Technologies, Grand Island,NY, USA）都提供这类服务。相较而言， gRNA引导的剪切只依赖于与目标DNA序列进行简单的Watson-Crick碱基配 对，因此不需要对每个目标位点进行复杂的蛋白质工程改造，而仅需修 改gRNA中20个碱基序列来识别不同的目标位点。 靶标：靶标： ZFNs理论上可以靶定任何序列，但实际上，目标的选择受限于模 块的可行性（基于序列依赖的组装平台合成）。利用公共数据库，基因 组DNA序列上平均每

21、100bp就可制备1个功能性ZFNs。 TALENs靶标受限于 需要第一个碱基是胸腺嘧啶，另外，不是所有的TALENs都能在体外有效 工作，而且一些还不能产生预期的突变，这就意味着每个TALEN对都需要 进行实验验证。比较而言， CRISPR/Cas9系统理论上仅需在目标位点上游 含有NGG（或NAG）PAM模体，但是，不能完好匹配的间隔序列可能会引 起脱靶剪切，因此gRNA的序列必须仔细设计，以避免脱靶发生，因此实 际上能剪切的目标位点会有所减少。 Xie et al.利用哺乳动物的 CRISPR/Cas9系统进行计算机模拟分析表明， 在8个代表性植物（拟南芥、蒺藜状苜蓿、大豆、番茄、短柄草

22、、水稻、 高粱、玉米）的基因组中，每100bp可鉴定到5-12个NGG-PAM，PAMs的数 量与基因组大小相关，相同基因组大小的单子叶植物较双子叶植物含有 更多的特异gRNA。除玉米外，可以设计特异gRNA编辑85%-99%的已注释 转录单元，其中68%-96%的转录单元含有至少10个不同的可定位NGG-PAM 位点；玉米是8个物种中基因组最大、被注释的基因数最多的物种，仅 30%的转录单元可以设计特异的gRNA进行编辑，这与基因组的复杂性和 序列结构相关。可以预测，小麦、大麦等基因组比玉米更大的物种可能 会面临相同的问题。但是，将来通过使用与有不同PAM要求的Cas9同源蛋 白，可以拓展C

23、RISPR/Cas系统在植物基因组中的应用范围。 CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较 剪切特点剪切特点： ZFNs和TALENs均携带限制性内切酶FokI的活 性域，能够产生带有粘性末端的一个DSB，其依据连接 子和间隔子的差异而有不同的长度。Cas9有两个剪切域 RuvC和HNH，在目标DNA序列PAM上游3个碱基处进行剪 切，产生平齐末端（在体外， Cas9偶尔也能产生1-2个 碱基的粘性末端）。特定的粘性末端对于DNA分子的精 细插入十分有益，它由NHEJ介导相容末端连接完成。利 用好双切口酶方法， CRISPR/Cas9系统也能产生这样的 结构。 效率效率： CRIS

24、PR/Cas9系统在植物中可实现高突变率，效 率与ZFNs和TALENs相当或更高。突变的效率受目标序列 差异、gRNA的序列或结构、Cas9的版本（不同物种的密 码子优化）和gRNA的表达策略等影响。而且报道的突变 率与分析方法的灵敏性有关，所以并不奇怪对于相同物 种不同人报道的突变率差异较大。 CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较 四、四、CRISPR/Cas9系统的优势系统的优势 简单（Simplicity）、易获取Accessibility 低成本（Cost）、用途广（versatility） 区别于ZFNs和TALENs，不需要蛋白质工程，因 此针对每个目标基因可检测

25、多个gRNA，更加 直接；不需要克隆，针对不同的目标特异性仅 需改变gRNA的20个碱基；任意数量的gRNA都 可以通过体外转录法，利用两条互补的退火寡 核苷酸链制备而成；大型gRNA库的组装因此 并不昂贵，从而使CRISPR/Cas9系统能够应用于 高通量功能基因组学研究，而且任何分子生物 学实验室都承担得起基因组编辑的预算费用。 区别于ZFNs和TALENs， CRISPR/Cas9系统能剪 切人类细胞中的甲基化DNA，从而进行遗传修 饰，这是其它核酸酶无法实现的。 植物中，这一方面还没有进行专门研究，但是 有理由相信剪切甲基化DNA是 CRISPR/Cas9系统 所特有的，并且与目标基因

26、组无关。 植物中大约70%的CpG/CpNpG都是甲基化的， 尤其是在启动子区及第一个外显子区的CpG岛。 因此，总体来说， CRISPR/Cas9系统对于植物 的基因组编辑更具通用性，尤其适合于GC含量 高的单子叶植物基因组，如水稻。 CRISPR/Cas9系统的优势 CRISPR/Cas9系统较ZFNs和TALENs，最主要的应 用优势是易于多位点编辑，即同时在多个位点 引入DSBs，从而同时编辑多个基因。尤其有利 于对冗余基因或代谢路径进行敲除。 相同的策略还可用于在同一染色体的两个相距 较远的剪切位点间引入大片段缺失或遗传转换。 利用CRISPR/Cas9系统进行多位点编辑仅需要单 个

27、Cas9蛋白和多个不同序列特异性的gRNA，相 反，使用ZFNs或TALENs进行多位点编辑需要针 对每个位点特异性的不同二聚体蛋白。 CRISPR/Cas9系统的优势 CRISPR研究界实施的开放获取政策也促进了 这一技术的快速传播和应用。与ZFN平台的 所有权性质不同， CRISPR研究界提供开放 性的质粒、网络工具（用于筛选gRNA序列 以及预测特异性），同时主持活跃的讨论 组。这些设施机构鼓励更多人利用这一技 术，进而促进了对其更深的了解与应用。 CRISPR/Cas9系统的优势 CRISPR/Cas9的特异性（relaxed specificity） CRISPR/Cas9系统存在的

28、一个争议是早期报道的相对较高 的脱靶突变，随后研发出了一些策略来减少脱靶编辑发 生 最重要的是谨慎设计gRNA（gRNA的脱靶效应可以快速、 便宜的检测出来） 优化核酸酶的表达（高浓度的Cas9和gRNA可以提高脱靶 效应） 采用突变的Cas9蛋白版本，将其转化为切口酶，使用两 个Cas9切口酶可以引入偏移的单链缺口，产生一个交错 的DSB，这个策略提高了识别碱基的特异性 失活的Cas9与FOKI融合 改变gRNA的长度 脱靶效应在相同物种的不同细胞类型中差异较大 CRISPR-Cas9基因编辑技术的研究及应用历史基因编辑技术的研究及应用历史 1987年，发现串联间隔重复序列（CRISPR）

29、2005年，推测CRISPR的生物功能（与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免 疫系统有关） 2007年，证实CRISPR序列与Cas基因结合抵抗病毒入侵，由此揭开了研 究CRISPR作用机制的序幕（2008-2011年） 2012年， CRISPR/Cas系统开始由生物现象发展为基因组编辑工具-只要 改变crRNA的20个核苷酸就可以简单地对目标DNA序列进行重新编程， 而且crRNA的定位特异性与tracrRNA的结构性能可以相结合组成一个嵌 合的单条引导RNA（gRNA），从而将三元系统三元系统简化为二元系统二元系统。 五、五、CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用基因编辑技术的应用 2013

30、年至今， CRISPR/Cas系统逐渐被广泛应用：（ CRISPR/Cas热潮） 在植物中， 2013年，5个独立的研究小组证实二元件系统在真核生物（人、鼠、斑马鱼） 中具备功能性，而且携带不同序列的多个gRNA能够同时在不同位点实现高效 的多重基因组编辑-说明CRISPR/Cas9系统是一个简单、成本低、作用广的基因 编辑工具。 2013年8月，5篇报道首次讨论了CRISPR/Cas9基因编辑在拟南芥、烟草、水稻 中的应用，随后的研究（2013-2014年）也报道了其在大豆、小麦、玉米、西 红柿等植物中的应用。其中，4个独立的小组发现， CRISPR/Cas9系统能在水 稻和西红柿转化体的第

31、一代就直接引入等位或同源突变，说明其在这两个物 种中尤其高效。此外，在拟南芥、水稻、西红柿中， Cas9/ gRNA系统诱导的 遗传变化出现在生殖细胞系，在随后的世代中会正常分离而不会进一步被修 饰。 植物育种中的应用和建议 传统的育种依赖于既有的自然遗传变异，而且 需要进一步的回交才能将选择的目标性状导入 优良背景里。因此，自然界中可用的有利变异 限制了育种能达到的效果。新的变异可以通过 随机突变获得，但是需要对大量群体，花费大 量时间进行筛选才能鉴定出具有期望表型的突 变。 基因编辑可以对优良遗传背景直接进行精准、 可预期的修饰，从而加快育种程序，由于可以 同时对多性状进行修饰， CRIS

32、PR/Cas9系统尤 其有效。 NHEJ介导的基因敲除是定点修饰最简单的应用。 如用于剔除降低粮食品质的基因、给予致病菌 敏感性、转换代谢流以获得有价值的众产品等. 利用寡核苷酸供体序列进行特定核苷酸的精准 替换能用于修饰调控农艺性状基因的DNA序列， 进而提高作物产量 有NHEJ或HR介导的大片段插入，能够在特定 位点引入提高转录水平的转基因，而不影响内 源基因的活性。 植物育种中的应用和建议 位点特异的核酸酶还可进行定向分子性状叠加。 实现将多个目标性状导入作物中，同时分离的 风险较低，这是传统育种，甚至是转基因育种 都难以做到的。一旦叠加完成，整个的分子序 列能通过杂交的方式转移到其它种

33、质中，因为 它是以单位点方式遗传的。虽然使用位点特异 性重组（ site specific recombination ）也能达 到这一目的，但是使用可编程的核酸酶结合精 准的NHEJ或HR进行定向整合不会留下与整合 方式相关的任何痕迹，如loxP或attB序列。 植物育种中的应用和建议 虽然欧洲管理机构判定转基因作物的焦点是产生过程而非产品本身， 由基因编辑技术如 CRISPR/Cas9系统，切除几个核苷酸而产生变化的 植物仍有希望和信心不被划定为转基因作物 使用可编程的核酸酶有几种方法可以产生不含转基因成分的突变植物。 包括使用农杆菌渗入法或病毒载体瞬时表达核酸酶组件以功能性 gRNA和Cas9蛋白形式，或者将在不同染色体上的gRNA和Cas9基因合并 在一起的形式，直接运送到目标位点，这样就可以通过遗传