孕产妇及所生儿童艾滋病检测-章三英

1、孕产妇及其所生儿童艾滋病检测 南充市顺庆区妇幼保健院 章三英 2015.11.25 全国艾滋病检测技术规范 National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2009年版） 检测依据 ： 2014年修订版还没正式推出 样本的采集和处理 1.对从其他实验室送的样品，注意检查并注明其送检单与标 本记录的符号.样品管遗漏.破损情况。如有遗漏要把残留的 样品移出，并对管壁和盛器消毒。要检查并记录样品的质量 有无溶血，脂血，细菌感染等情况。 2.对实验室自己采集的标本，注意是血液先自然存放1-2小时 候，再用3000rpm离心15分钟，吸出上清液备用，如要几天

2、内检查可放入2-8冰箱，要储存则置于-20低冰箱内。 3.滤纸片的采集.用移液管从样品管中吸取100uL抗凝全血或 血浆，对准滤纸片印圈中心处蒋样品滴在滤纸上，或者穿刺 后自皮肤伤口流出的末梢血直接滴加在滤纸印圈的中心处。 在室温下自然干燥至少4小时，不要加热或堆叠，自然干燥 后放入密封袋中。 报告 “HIV抗 体 阳 性 ” 报告 “HIV抗 体 阴 性 ” 无反应 提供疑似阳性咨询 进一步做补充试验 不确定 无反应 两种均无反应 或原有试剂双份进行复检 两种均有反应 或 一有反应一无反应 有反应 原 有 试 剂 +另 一 种 筛 查 试 剂 进 行 复 检 提供咨询 进行核酸检测等 其他补

3、充试验 孕期艾滋病检测及服务流程 孕期初次接受产前保健的孕妇 主动提供有关的检测信息 采 集 血 样 本 ， 进 行 HIV抗 体 筛 查 试 验 检测后咨询、指导 常规孕产期保健 检测后咨询、指导 进行传染病信息报告 提供后续干预服务 流行病学史 无 有 进行核酸检测或 2-4周 后 随 访 补充试验 （首选抗体补充试验） 有反应 婴儿艾滋病感染早期诊断工作方案 对HIV阳性产妇所生儿童于出生后6周和3个月时， 分别采集血标本，进行婴儿感染早期诊断。详见图 3婴儿艾滋病感染早期诊断检测及服务流程。 未进行婴儿早期诊断检测或婴儿早期诊断检测结果 为阴性的儿童，应于12、18月龄进行艾滋病抗体筛

4、 查及必要的补充试验，以明确艾滋病感染状态。儿 童抗体检测及服务流程见图7。 提供咨询 继续提供干预服务 尽早获得检测结果 产后暂时未得到补充试验结果或 补 充 试 验 结 果 为 “不 确 定 ” 分娩前快速 检测结果两 种均阳性者 “HIV抗 体 阴 性 ” 提供咨询 终止干预 提供咨询 终止干预 提供咨询， 进行核酸 检测等其他 补充试验 有反应 报告 不确定 一有反应一无反应 检测后咨询，知情选择干预措施 及时应用抗艾滋病病毒药物； 适宜、安全的助产服务 尽早进行补充试验，及时获得检测结果 （首选抗体补充试验） 产时艾滋病检测及服务流程 （适用于孕期未接受艾滋病检测的产妇） 孕 期 未

5、 接 受 HIV抗 体 检 测 的 临 产 产 妇 主动提供相关检测信息，采集血样本 同时用两种不同的快速检测试剂 进 行 HIV抗 体 筛 查 试 验 两种均有反应 或 两种均无反应 报 告 “HIV抗 体 阴 性 ” 检测后咨询、指导 常规助产及服务 “HIV抗 体 阳 性 ” 提供咨询，进行 传染病信息报告 继续提供干预服务 所生新生儿特别 护理、应用抗病毒 药物；喂养指导、 营养咨询等 感染妇女纳入当地艾滋病 防治系统 所生儿童继续随访、进行 艾滋病相关检测 无反应 报告 分娩前快速检测结果为一 有反应一无反应者， 用另一种筛查试剂 再次检测 无反应 有反应 艾滋病感染孕产妇所生儿童艾

6、滋病抗体检测及服务流程（图3） 艾滋病感染产妇所生儿童 早期诊断检测结果阴性；或未接受早期诊断检测、 感染状态不明确者 12个 月 进 行 HIV抗 体 筛 查 试 验 无反应 用另一种筛查试剂再次检测 有反应 无反应 有反应 18个 月 时 再 进 行 HIV抗 体 筛 查 试 验 无反应有反应 不确定 提供咨询， 进行核酸 检测等其他 补充试验 无反应 用另一种筛查试剂 有反应 再次检测 报 告 “HIV抗 体 阴 性 ” 排 除 儿 童 HIV感 染 常规儿童保健随访 两 种 均 无 反 应 原 有 试 剂 +另 一 种 筛 查 试 剂 进 行 复检 或 原有试剂双份进行复检 两种均有反

7、应 或 一有反应一无反应 补充试验 （首选抗体补充试验） 有反应 无反应 报 告 “HIV抗 体 阳 性 ” 诊 断 儿 童 HIV感 染 进行传染病信息报告 提供转介服务 随访并监测病情 18个月以下婴幼儿的HIV检测诊断 母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿，出生时 新生儿和婴儿早期抗体有反应，不一定是感 染 出生时母亲的抗体，8090% 在生后 912 个月消失，出生后 18 个月基本上全部 消失 18 个月后儿童 HIV 仍然有反应，视为自 身感染产生的抗体 18个月以下婴幼儿的HIV检测诊断 检测HIV DNA或RNA 推荐检测HIV DNA, 因为HIV前病毒DNA 以细胞内前病毒感染

8、状态存在，所以它不受 母亲围产期抗病毒治疗的影响和婴幼儿预防 性抗病毒治疗的影响 HIV DNA 的适宜月龄为3-6个月 不得使用脐带血. HIV/AIDS实验室检测 诊断性检测 初筛实验：ELISA、化学发光（CLIA)、快速检测（RT） 、PA等 确认实验（补充实验）：蛋白免疫印迹试验(WB) 条带/线性免疫试验（RIBA/LIA） 婴儿诊断：HIV DNA 病情判定检测 T细胞亚群检测：流式细胞仪技术 HIV RNA检测：病毒载量 HIV耐药检测 表型耐药：细胞培养技术 基因型耐药：序列测定，杂交技术 疫胶体 金（或胶体硒）快速试验 初筛实验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光 快

9、速检测（RT）及其它检测 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。 4.酶催化底物并显色。 酶 抗原 酶标记 抗原 抗体 抗原 固相载体 双抗原夹心法示意图 16 结果判定：以梅里埃第三代ELISA（双抗原夹心法）为例 阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2） NC 必须0.25方可用，排除NC0.25的值，计算NC平均值。 NC界限范围：0.6倍NC均值NC1.4倍NC均值。 符

10、合以下条件的实验成立： 两个以上的NC可用。 PC1-NC均值 0.4，PC2-NC均值 0.4 Cut off值 = 阴性对照均值 + 0.100 小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性 化学发光法结果判断 S/CO 1.00的样本被认定为非反应性(NR)。 S/CO 1.00的样本被认定为反应性(R)。 初始结果为有反应性的样本必须经离心后以复检。 18 19 筛查实验注意事项 ELISA法 1.实验前 试剂室温下平衡 2.样品 血清、血浆分离好 3.加样 避免溅出或产生气泡、及时放入孵箱 4.孵育 温度、湿度及时间 5.洗板 保证洗液注满各孔，洗板针畅通 6.显色 临用

11、前配制、避免接触金属器械 7.加液 避免产生气泡 8.读板 保证酶标板底部清洁 20 化学发光法 血清、血浆分离好 注意观察是否有没加上标本的（机器会有 报警） 21 ELISA检测的干扰因素 一、内源性物质 （1）类风湿因子 （2）补体 （3）嗜异性抗体 （4）标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红 素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测定 结果 有干扰作用 二、外源性物质 （1）标本溶血 （2）标本受细菌污染 （3）标本凝集不全 （4）标本管中添加物质的影响 24 化学发光法检测的干扰因素 异嗜性抗体 经常接触动物或动物血清产品的患者 接受过小鼠单克隆抗体制剂诊断或治疗的患者 免

12、疫胶体金（或胶体硒）快速试验 与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。 区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体 金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。 免疫层析法 样品垫: 加入血浆,血清或全血样品.红细 胞在此迁移过程中被去除 连接物垫:含分析特异性试剂结合的硒 标,为一种肉眼可见的红色信号,被分析 物和硒标特异性试剂在此反应结合 病人条:固定的含特异性分析试剂,任何 与硒标特异性试剂结合的分析复合物在 此被结合固定,形成三文治结合物,肉眼 可见的红色线条说明有有反应性 质控条:固定的含捕捉硒标物的特异性 试剂,不管样品中有无被检测物都应出 现红色线条.控制测试结果的有效性 撕下

13、所需的测试纸条数,撕下表面保护膜 血清/血浆样品 加50ul样品于样品垫中15分钟内读取结果 全血样品 加50ul样品于样品垫中 手指血方法 加一滴缓冲液 静脉血方法 15分钟内读取结果 病人条 质控条 结果报告： 对呈无反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告； 对呈有反应的样品，需要进一步做复检试验和确 证试验。 对初筛试验呈有反应者不能出阳性报告，可出具 “ HIV 抗体待复检”报告。 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版） HIV抗体检测复检试验 复检试剂： 应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家） 的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试 剂进行复检试验。 。 如果初筛检测使用

14、抗原抗体联合试剂，则复检 必须包括一种抗原抗体联合试剂。 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版） HIV抗体检测复检试验 复检结果处理： 如果两种试剂复测均呈无反应，则报告HIV抗体阴性；。 如均呈有反应，或一无反应一有反应，需送艾滋病确认实验 室进行确认。报告为“HIV抗体待复检”。 HIV抗体复检报告有固定的表格，需由1名检验人员和1名审核 人员签字。 对初筛试验呈有反应者不能出阳性报告，可 出具“ HIV 抗体待复检”报告 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版） 样本 均有反应 一无反应一有反应 送确认 均无反应性 阴性报告 有反应 复检试验 原有试剂和另外一种不同 原理（或厂家）的

15、试剂 另外两种不同原理或不同 厂家的试剂进行复检试验。 筛查试剂 初筛检测 无反应 阴性报告 HIV抗体初筛检测流程图 初筛试验呈有反应性样品的转送： 需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证 号码），必要时采集第二份血样，持HIV抗体筛查报 告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实 验室复检。 无论筛查无反应和有反应者，均需做好检测后咨询。 HIV抗体确认试验 确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批 准、在有效期内的试剂。 确认试验方法： 包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验、 放射免疫沉淀试验及免疫荧光试验（IFA）等。 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版）

16、蛋白印迹实验（WB） 广泛使用的确认实验 基本原理 HIV全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,将分子量 大小不等的HIV抗原蛋白带分离开来,然后再把这些 已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。 将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经 电泳分离过的HIV病毒抗原。 试剂盒包括 1.硝酸纤维膜（试剂膜条） 2.阴性对照 3.强阳性对照 4.弱阳性对照 5.浓缩样品稀释缓冲液(10) 6.浓缩洗膜缓冲液( 20) 7.酶结合物 8.底物液 9.封闭粉 10.孵育板， 11.使用手册 12.镊子 18或36条 1管 1管 1管 1瓶 1瓶 1管 1瓶 10袋 2或4块板 1本 1支 原理

17、加样 洗 加酶结合物 (Ab-HRP) 洗 加底物 HIV-1 病毒裂解蛋白 HIV-2 多肽条带 内对照 可选快速或过夜检测方法 其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做 确认试剂。 不同的研究机构有不同的判定标准 gp140/gp105、gp36， 也可为gp125/gp80、gp36 p56、p26、p16 p68、p53、p34 gp160/gp120 gp41 p55、p24、p17 （或p18） p66（或p65）、p51、 p31 env gag pol HIV-2抗体特异带HIV-1抗体特异带 WB结果判定标准 无条带或只有P17 无条带 2 ENV+GAG+POL 1

18、 ENV + p24/p31 WHO FDA（USA） 阴性阳性组织 我国的判断标准 HIV-1抗体阳性 同时符合以下2条标准可判为HIV-1抗体阳性：至少有2条env带（gp41和gp160/gp120） 出现，或至少1条env带和p24带同时出现；符合试剂盒提供的阳性判定标准 HIV抗体不确定 出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性 HIV抗体阴性 无HIV抗体特异带出现 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版） HIV抗体确认实验结果 a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2） b弱阳性对照（HIV-1） c阴性对照 d典型的HIV-2血清阳性反应 abcd gp160 gp120 p66

19、 p55 p51 gp41 p39 p31 P24 p17 血清对照 HIV-2特异带 试验中应注意的问题 1.充分浸泡 2.充分洗涤 3.显色时间 等等 HIV抗体确认实验流程图 结果汇报 符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性（）”； 符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性（）”， 并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。 符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（）”。如疑 似“窗口期”感染，建议进一步做HIV-1P24抗原检测和HIV核酸检 测，尽早明确诊断。 符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（）”， 在备注中应注明“

20、4周后复检”。 全国艾滋病检测技术规范（ 2009 版） 晚期病例 在我院一中年男性患者，高烧1月余，肺部感染，有鹅口疮， CD4绝对计数是6个/ul ，3代试剂筛查呈阳性，快速阳性，WB 带型为gp160，gp120，gp41。 抗机会性感染一个月后，抗体筛查阳性，快速阳性、 P24抗 原阳性， WB带型gp160，gp120，gp41，p24。 55 婴幼儿HIV感染核酸检测 中国婴儿早期诊断依据 5.4 婴儿早期诊断 5.4.1 适用范围 未满18个月的HIV感染 产妇所生婴幼儿； 母亲HIV感染状态不详 ，出现HIV相关临床表 现，临床怀疑HIV感染 者。 58 HIV-1 滤纸片干血斑样品检测技术 （Dried Blood Spot， DBS） 60 临床应用 67 婴儿，18个月儿童 缺点：污染 87 影响病毒载量测定结果的因素 88 血浆和血清标本 测定病毒载量应该首选血浆标本 血清的检测结果大约是血浆的50%（ 30- 80% ） 89 用EDTA 抗凝剂的采血管采集全血后分离血浆样 本,其HIV1RNA 含量比ACD 和肝素抗凝管中相 应含量多10 %15 %及20 %25 %。 90 如果必须用RT-PCR方