分子荧光分析法1 (1)

1、荧光及荧光分析荧光及荧光分析 荧光及荧光分析荧光及荧光分析 n概述概述 n基本原理基本原理 n荧光分析荧光分析 n仪器与技术仪器与技术 n应用与示例应用与示例 光学光谱区光学光谱区 远紫外远紫外近紫外近紫外 可见光可见光 近红外近红外中红外中红外 远红外远红外 （真空紫外）（真空紫外） 10nm200nm200nm 380nm 380nm 780nm 780 nm 2.5 m 2.5 m 50 m 50 m 300 m 什么是荧光什么是荧光 ？ 荧光基础理论荧光基础理论 当当紫外或可见光紫外或可见光照射到照射到某些某些物质上时，这物质上时，这 些物质就会些物质就会发射发射出波长和强度各不相同的

2、出波长和强度各不相同的 光线，停止照射光照射时，这种光线光线，停止照射光照射时，这种光线马上马上 或逐渐或逐渐消失，这就是荧光消失，这就是荧光。 荧光的发现及发展荧光的发现及发展 l 1575年年，西班牙医生，西班牙医生N. MonardesN. Monardes首先发现荧光首先发现荧光 l 1852年，年，StokesStokes发现发现荧光波长比照射光波长荧光波长比照射光波长 要长要长，认定荧光是发射光。，认定荧光是发射光。 l 1867年，年，首次用于分析测定。首次用于分析测定。 l 1952年，年，商品荧光分光光度计出现。商品荧光分光光度计出现。 l 2008年，年，日本村修、美国马丁

3、日本村修、美国马丁沙尔菲、沙尔菲、美籍美籍 华裔钱永健华裔钱永健因发现并发展了因发现并发展了绿色荧光蛋白质绿色荧光蛋白质技技 术而获诺贝尔化学奖。术而获诺贝尔化学奖。 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化 学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激 发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧 光和磷光。 荧光产生的基本原理荧光产生的基本原理 分子发光的类型 分子发光的类型可以按两种不同的办法加以分类,其中一种以激发 的模式加以分类,另一种是按分子激发态的类型来分类. 按分子激发态的类型可分为荧光

4、和磷光, 荧光:由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象. 磷光:由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象. 按激发模式分类,可分为: a.光致发光:分子因吸收外来辐射的光子能量被激发所产生的发 光. b.化学发光:分子的激发能量是由反应的化学能提供. c.生物发光:分子的激发能量是由生物体释放出来的能量提供. d.热致发光:由热活化的离子复合激发模式所引起的发光现象. e.场致发光:由电荷注入激发模式所产生的发光. f.摩擦发光:由摩擦激发模式所产生的发光. 单重态和三重态单重态和三重态 电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和

5、为电子自旋量子数的代数和 (0或或1)； 单重态单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：三重态：分子具有自旋不配对的电子，分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三重态能级比相应单重，三重态能级比相应单重 态能级低；态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； 基态单重态基态单重态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态 区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。 电子跃迁类型

6、电子跃迁类型 允许跃迁允许跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁 S0S1, S2, S3 T1, T2, T3 在单重激发态中，两个电子平行自旋，在单重激发态中，两个电子平行自旋， 单重态分子单重态分子具有具有抗磁性抗磁性，其激发态的，其激发态的平均寿平均寿 命命大约为大约为10-8s，而，而三重态三重态分子具有分子具有顺磁性顺磁性， 其激发态的平均寿命为其激发态的平均寿命为10-4 1s以上（通常用以上（通常用 S和和T分别表示单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。 电子跃迁类型电子跃迁类型 激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性

7、）抗磁性 激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性）顺磁性 区别：电子自旋方向不同，区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。激发三重态的能级稍低一些。 电子跃迁电子跃迁 处于激发态的电子，通常以处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式辐射跃迁方式或或无无 辐射跃迁方式辐射跃迁方式再回到基态。再回到基态。 辐射跃迁辐射跃迁主要涉及到主要涉及到荧光、延迟荧光荧光、延迟荧光或或磷光磷光的发的发 射；射； 无辐射跃迁无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能则是指以热的形式辐射其多余的能 量，包括量，包括振动弛豫（振动弛豫（VR

8、）、内转移（内转移（IR）、外外 转移（转移（EC）及及系间窜越系间窜越（ISC）等，各种跃迁方）等，各种跃迁方 式发生的可能性及程度，与式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构荧光物质本身的结构 及及激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素有关。有关。 处于单线态和三线态下的分子的电子受激发 激发单重(线)态：分子吸 收能量，电子自旋仍然配 对，为单重(线)态，称为 激发单重态，以S1，S2 表示 激发三重(线)态：分子吸收能量， 电子自旋不再配对为三重，称 为激发三重态，以T1，T2.表 示。 基态：电子自 旋配对多重度 =2s+1=1，为 单重(线)态，以 S0表示。

9、分子的去激发分子的去激发 无辐射跃迁无辐射跃迁 辐射跃迁辐射跃迁 荧光（荧光（F） 磷光（磷光（P） 振动弛豫振动弛豫 内转移内转移 外转移外转移 体系间跨越体系间跨越 分子的去激发分子的去激发 辐射跃迁辐射跃迁 荧光：荧光：受光激发的分子从受光激发的分子从第一激发单重态第一激发单重态的最低振的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大， 速率常数速率常数kf为为106109s-1。 磷光：磷光： 从从第一激发三重态第一激发三重态的最低振动能级

10、回到基态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 10s。 在光照停止后，仍可持续一段时间在光照停止后，仍可持续一段时间。 振动弛豫振动弛豫 它是指它是指 在同一电子能级在同一电子能级中，中，电子由高振动电子由高振动 能级转至低振动能级，而将多余的能量以能级转至低振动能级，而将多余的能量以 热的形式发出热的形式发出。发生振动弛豫的时间为。发生振动弛豫的时间为10- 12s数量级 数量级。 无辐射跃迁无辐射跃迁 内转换内转换 当当两个电子能级两

11、个电子能级非常靠近以至其振动能非常靠近以至其振动能 级有级有重叠重叠时，常发生电子由高能级以时，常发生电子由高能级以无辐无辐 射跃迁方式射跃迁方式转移至低能级。转移至低能级。 无辐射跃迁无辐射跃迁 外转移外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相 互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至 消失。这一现象称为消失。这一现象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。 荧光与磷光的根本区别荧光与磷光的根本区别： 荧光荧光是由激发是由激发单重态单重态最低振动能层至基态各最低振动能层至基态各 振动能层间跃迁产生的；而振动能层间

12、跃迁产生的；而磷光磷光是由是由激发三重态激发三重态 的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。 无辐射跃迁无辐射跃迁 系间窜越系间窜越 指指不同多重态间不同多重态间的的无辐射跃迁无辐射跃迁， 例如例如S1T1就是一种体系间跨跃。就是一种体系间跨跃。 通常，发生体系间跨跃时，电子通常，发生体系间跨跃时，电子 由由S1的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至T1的的 较高振动能级处。有时，通过热较高振动能级处。有时，通过热 激发，有可能发生激发，有可能发生T1S1，然后，然后 由由S1发生荧光。这是产生发生荧光。这是产生延迟荧光的机理延迟荧光的机理。

13、改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。 无辐射跃迁无辐射跃迁 hv A h vF S1 T1 S0 h v P 荧光产生的基本原理 内转换（Internal Conversion，IC）: 对于具有相同多重度相同多重度的分子，若较高 电子能级的低振动能层与较低电子能 级的高振动能层相重叠时，则电子可 在重叠的能层之间通过振动耦合产生 无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 系间跨跃 （ Intersyste m Conversion， ISC）:系间 跨跃是发 生在两个 不同多重 态之间的 无辐射跃 迁，如从S1 到T1，该跃 迁是禁阻 的

14、。然而， 当不同多 重态的两 个电子能 层有较大 重叠时， 处于这两 个能层上 的受激电 子的自旋 方向发生 变化，即 可通过自 旋-轨道耦 合而产生 无辐射跃 迁，该过 程称为系 间跨跃。 荧光:分 子电子 从单重 激发态 的最低 振动能 级在很 短时间 （10-9- 10-6s） 跃迁到 基态各 振动能 层时所 产生的 光子辐 射称为 荧光。 磷光: 分子电 子从三重态最 低振动能层， 跃迁到基态的 各振动能层所 产生的辐射。 S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越系间跨越 内转换内转换 振动弛豫振动弛豫 能 量 l l 2l l 1

15、l l 3 外转换 l l 2 T2 内转换内转换 振动弛豫 5）荧光发射 分子电子从单重激发态（Kasha规则）的最低振动能级 在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光 子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常 要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效 应）。 6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振 动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基 态的各振动能层所产生的辐射。 0 0 S S 光光发发射射 （低低振振动动能能层层） 1 1 T T 振振动动弛弛豫豫 （高高振振动动能能层层）

16、 1 1 T T 系系间间跨跨跃跃 1 1 S S 磷磷 荧光的类型 发射机制考虑：瞬时荧光和迟滞荧光 （1）.瞬时荧光:通常在吸收激发光后大约10-8s 内发射的,是由 激发过程中最初生成的S1电子态所产生的辐射.瞬时荧光可能由 处于S1电子态的分子或S1激发态分子与基态分子所形成的激发 态二聚体产生的. 低浓度(10-6M)芘溶液,荧光是 紫色的,荧光光谱有结构特征 高浓度(10-3M)芘溶液,荧光是蓝 色的,荧光光谱没有结构特征 (2).迟滞荧光 物质分子在刚性或粘稠介质中,除了磷光谱外,还可能观察 到另一种长寿命的发射谱带,但这个发射谱带波长比磷光谱带 波长要短.往往把这种长寿命发射的

17、谱带称为迟滞荧光.迟滞 荧光分为E-型迟滞荧光,P-型迟滞荧光和复合荧光三种类型. .E-型迟滞荧光: 处于T1电子态的分子,经热活化提高能量后而处于S1电子能态, 然后自S1电子态辐射跃迁产生荧光. .P-型迟滞荧光: 这类荧光,其S1电子激发分子的布居,是由两个处于T1电子态 的分子相互作用时所引起的,此过程称为“三重态-三重态粒子湮(yan) 没”,结果产生一个激发单重态分子. .复合荧光 其第一电子激发单重态分子的布居，是由自由基离子和电子复 合或具有相反电荷的两个自由基离子复合引起的。 荧光的类型 n比较荧光和激发光的波长考虑： n.斯托克斯（stokes)荧光 n.反斯托克斯荧光（

18、antistokes) n.共振荧光 .斯托克斯（stokes)荧光 在溶液中观察到的荧光,其发射的荧光比激发光的波长要长. 激发光 荧光 分子碰撞引起的能量损失 S0 S1 .反斯托克斯荧光（antistokes) 如果在吸收光子的过程又附加热能给予激发态分子,则 发射的荧光波长比激发光的波长短.这种荧光可在高温的 稀薄气体中观察到. 激发光荧光 吸收热能 S0 S1 .共振荧光 与激发光具有相同波长的荧光,这类荧光在气体和结晶 才有可能发生. 激发光 荧光 S0 S1 荧光的检测荧光的检测 单色器单色器 光源光源 检测器检测器 狭缝狭缝 单色器单色器 吸吸 收收 池池 狭缝狭缝 ex em

19、 I0It 荧光测量荧光测量 荧光的检测 光谱特征 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光 谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。 1）激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度 变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完 全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适 宜的激发波长。 2）发射光谱）发射光谱 发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波 长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，长辐照荧光物质，

20、产生不同波长的强度的荧光， 以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。 由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用 荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。 激发光谱和发射光谱 由于分子对光的选择性吸收,不 同波长的入射光便具有不同的激发效 率.如果固定荧光的发射波长(即测定 波长,不断改变激发光(入射光)的波 长,并记录相应的荧光强度.所得到的 荧光强度对激发波长的谱图称为荧光 的激发光谱.如果使激发光的波长和 强度保持不变,而不断改变荧光的测 定波长(发射波长)并记录相应的荧光 强度,所得到

21、的荧光强度对发射波长 的谱图则为荧光的发射光谱. 由于不同物质具不同的特征发射 峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴 别荧光物质。如右图所示。 i）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产 生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致） ii）形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激后可到达 不同能层的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到 第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达 第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激 发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。 激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 温州大学化材

22、学院微纳结构材料 & 物理化学研究所 iii）镜像对称）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 荧光为第一电子激发单重 态的最低振动能层跃迁到基态 的各个振动能层而形成，即其 形状与基态振动能级分布有关。 吸收光谱是由基态最低振 动能层跃迁到第一电子激发单 重态的各个振动能层而形成， 即其形状与第一电子激发单重 态的振动能级分布有关。 由于激发态和基态的振动 能层分布具有相似性，因而呈 镜像对称。 解释解释1：能层结构相似性：能层结构相似性 荧光寿命和荧光量子产率 荧光寿命和荧光量子产率 nF1和F2分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；F1和F

23、2分别表 示待测物质和参比物质的积分荧光强度；A1和A2分别表示待测物质和参 比物质在激发波长下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的荧光量 子产率为0.55,是测量荧光量子产率时经常使用的一种参照物.) 荧光量子产率的测量方法 分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构）分子具有与辐射频率相应的荧光结构 （内因）；（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定）吸收特征频率的光后，应可产生具一定 量子效率的荧光。量子效率的荧光。 即量子效率即量子效率 F足够大：足够大： 吸吸收收的的光光

24、量量子子数数 发发射射的的荧荧光光量量子子数数 F=kf/(kf+K) 分子结构与荧光分子结构与荧光 1）跃迁类型：）跃迁类型： 通常，具有通常，具有 *及及n *跃迁结构的分子跃迁结构的分子 才会产生荧光。而且具才会产生荧光。而且具 *跃迁的荧光效率比跃迁的荧光效率比 n *跃迁的要大得多。跃迁的要大得多。 2）共轭效应：）共轭效应： 共轭度越大，荧光越强。共轭度越大，荧光越强。 共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系 lex=205nmlex=286nm lex=356nm lem=278nmlem=321nmlem=404nm F=0.11 F=0.29F=0.36 提高共轭度有利于提

25、高共轭度有利于增加荧光效率增加荧光效率并产生并产生红移红移。 分子结构与荧光分子结构与荧光 3）刚性结构和共平面性）刚性结构和共平面性： 分子分子刚性刚性（Rigidity）越强越强，分子，分子振动少振动少， 与其它分子碰撞失活的机率下降，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量荧光量 子效率提高子效率提高。 如荧光素（如荧光素（ 大）与酚酞（大）与酚酞（ =0）；）； 分子结构与荧光分子结构与荧光 刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系 OH NN O Mg1/2 8 羟基喹啉羟基喹啉8 羟基喹啉镁羟基喹啉镁 形成络合物后形成络合物后, ,形成刚性平面形成刚性平面 刚性结构

26、和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系 SO3Na N CH3 CH3 SO 3Na N CH3H3C 7 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸盐磺酸盐 F =0.75 8 - 二甲胺萘二甲胺萘 1 - 磺酸盐磺酸盐 F =0.03 空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系 刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系 CC H H CC H H 反式结构，发光反式结构，发光顺式结构，不发光顺式结构，不发光 1，2二苯乙烯二苯乙烯 空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系 分子结构与荧光分子结构与荧光 4）取代基：）取代基： 给电子取代基增强荧光（给电子取代基增强荧

27、光（p- 共轭），如共轭），如 -OH、-OR、 -NH2、-NR2等；等； 吸电子基降低荧光，如吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；等； 重原子降低荧光但增强磷光，重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐 渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。 取代基的影响取代基的影响 OH 给电子取代基给电子取代基 增强荧光增强荧光 NH2, NHR, NR2, OH, OR, 等等 l lEM 285-365 nm270-310 nm310-405 nm 相对荧光强度相

28、对荧光强度 1.8 1.0 2.0 N H H 吸电子取代基吸电子取代基 N+ O OC O C O O n 电子不与电子不与 电子共轭电子共轭 羰基类羰基类 1）n* 跃迁禁阻，跃迁禁阻， 小，小，10-2 2）最低单重态为）最低单重态为 n, * 型，易于型，易于ISC。荧光弱，磷光强荧光弱，磷光强 非荧光非荧光强荧光强荧光 O O OH OH 取代基的位置取代基的位置 COOH OH C O H O H O 1） 有利于有利于电子离域的，则荧光增强。电子离域的，则荧光增强。 因此，一般因此，一般 邻位、对位邻位、对位给电子基团导致荧光增强。给电子基团导致荧光增强。 2）有利于形成环，导致

29、分子刚性增大，荧光增强。）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。 荧光强度较弱荧光强度较弱 荧光强度较强荧光强度较强 COOH COOH OH HO 重原子效应重原子效应 重原子降低荧光但增强磷光重原子降低荧光但增强磷光 如苯环被卤素取代，从氟苯如苯环被卤素取代，从氟苯 到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。 N N N N O H3C CH3 CH3 O F 0.22 10-5 P 0.14 0.43 P 1.9 s 0.024 s N N N N S H3C CH3 CH3 O 重原子效应重原子效应 不含有杂原子（不含有杂原

30、子（N,O,S）的有机化合物均属于这一）的有机化合物均属于这一 类，其特点是类，其特点是自旋允许跃迁自旋允许跃迁， 大，大， 104，荧光强荧光强 , * 1) 含有杂原子（含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一）的有机化合物多属于这一 类，含有类，含有n 电子，其特点是电子，其特点是自旋禁阻自旋禁阻 ， 小，小， 102, ISC速率大速率大，荧光弱荧光弱。 2) n 轨道的能量受环境的影响大轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成，如质子化或生成 氢键等，将使氢键等，将使n 轨道的能量降低，导致轨道的能量降低，导致n*跃迁的跃迁的 能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成能量增大。荧

31、光分子的最低激发态可能变成 , *。 分为两类分为两类 含氮杂环有机物含氮杂环有机物 含羰基杂原子有机物含羰基杂原子有机物 n, * 最低单重态的性质最低单重态的性质 含氮杂环有机物含氮杂环有机物 荧光随溶剂极性的增大而增强荧光随溶剂极性的增大而增强 例例1 喹啉喹啉 介质介质 苯苯 乙醇乙醇 水水 相对荧光相对荧光 1 30 1000 N 可以理解为可以理解为N上的孤对电子与水形成氢键，使上的孤对电子与水形成氢键，使n轨道能量轨道能量 降低，从而使最低单重激发态由降低，从而使最低单重激发态由n, *变成变成 , *。 含羰基有机物含羰基有机物 芳香类芳香类S1与与T1能级间隙小，能级间隙小，

32、 ISC效率高，接近于效率高，接近于1。 脂肪类脂肪类有微弱的荧光，有微弱的荧光，ISC效率低一些效率低一些 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素 （一）溶剂效应：（一）溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度溶剂极性可增加或降低荧光强度 （改变（改变 *及及n * 跃迁的能量）；跃迁的能量）； 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增 加或降低荧光强度。加或降低荧光强度。 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素 （二）温度：（二）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换 增加、粘度或增加、粘度或“刚性刚性”降低）。因此体系

33、降低温降低）。因此体系降低温 度可增加荧光分析灵敏度。度可增加荧光分析灵敏度。 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素 （三）（三）pH值：值： 具酸或碱性基团的有机物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值值 时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生 改变；对无机荧光物质，因改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定值会影响其稳定 性，因而也可使其荧光强度发生改变。性，因而也可使其荧光强度发生改变。 OH- H+ NH4+ H+ OH- NH2NH- pH 13pH712 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素 （四）内滤光和自吸：（四）内滤光

34、和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或体系内存在可以吸收荧光的物质，或 荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有 重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光； 当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧 光发射称为荧光自吸。光发射称为荧光自吸。 荧光猝灭荧光猝灭 H hv hv k* ,k* * 1 QMQM MM MM 2 * ,* hv hv AA DD )(A)D()A()(D )(A)D()A()(D 1 * 001 1 * 001 SSST SSSS * * N CH3 CH3 N CH

35、3 CH3 + _ 荧光猝灭荧光猝灭 2 3*3 2 31 OMOM 1 k* kT M2M)M(MM *3*3*3 荧光猝灭荧光猝灭 * * hv hv DD DD D)(DDD 11* 荧光猝灭荧光猝灭 单色器单色器 单色器单色器 光源光源 。 检测器检测器 液液 槽槽 放大和指示仪表放大和指示仪表 荧光分光光度计的结构示意图荧光分光光度计的结构示意图 I0 I 仪器结构示意图仪器结构示意图 仪器与技术仪器与技术 n 荧光计的主要部件荧光计的主要部件 1 1）光源：）光源：氙灯、高压汞灯、激光；氙灯、高压汞灯、激光； 2 2）样品池：）样品池：石英（低荧光材料）；石英（低荧光材料）； 3

36、3）两个单色器：）两个单色器： 选择激发光单色器；分离荧光单色器；选择激发光单色器；分离荧光单色器； 4 4）检测器：）检测器：光电倍增管。光电倍增管。 基本装置及主要构件基本装置及主要构件 1 1、激发光源、激发光源 （1）条件: 足够的强度 紫外，可见区域有连续的光谱 强度与波长无关 光强稳定 （2）激发光源: 氙灯（高压）: 2501000nm光谱区呈连续光谱，使 用寿命大约为2000h。 汞灯（高压）:在紫外区激发，365nm，使用寿命 15003000小时。 2 2、单色器、单色器 光栅单色器 有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱， 主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，

37、可 用前置滤光片加以消除。 滤光片 滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有 广泛的应用。 基本装置及主要构件基本装置及主要构件 3、样品池 石英方形池，四面都透光。 4、狭缝 狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。 基本装置及主要构件基本装置及主要构件 5、检测器 光电倍增管：灵敏度高，线路简单。 光电摄像管：具有检测效率高，动态范围 宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。 6、读出装置 记录仪、阴极示波器和显示器。 基本装置及主要构件基本装置及主要构件 荧光定量分析荧光定量分析 CL t eTLC I I TA 303. 2 0 ,lglg LC. t eT I I 3032 0

38、111 )1 ( 3032 00 LC. t eIII )1 ()( 3032 00 LC. tF eIIII !n x !4 x !3 x !2 x !1 x 1e n432 x ) !4 )bC30. 2( !3 )bC30. 2( !2 )bC30. 2( bC30. 2(II 432 0F CLIkI FF0 30. 2CLIkI PP0 30. 2 CKIF KCIP 荧光定量分析荧光定量分析 荧光分析的特点：荧光分析的特点： 灵敏度高灵敏度高：视不同物质，检测下限在视不同物质，检测下限在0.10.0010.10.001 g/mLg/mL之之 间。可间。可 见比见比UV-VisUV-Vis的灵敏度高得多！的灵敏度高得多！ 选择性好选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多结构信息量多：包括物质