高效液相色谱的维护与保养

1、高效液相色谱的维护与保养高效液相色谱的维护与保养 液相色谱仪器的使用及保养 色谱泵的保养色谱泵的保养 流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用 水冲洗柱塞杆清洗孔 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为 准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性, 如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均 须用水过渡 流动相的脱气流动相的脱气 流动相脱气的目的 .使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 .提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 .保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动

2、相脱气的方法流动相脱气的方法 加热 .简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动 相组成的变化 抽真空 .同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 .简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） .可保持连续脱气，多用于低压梯度 在线脱气机 .可保持连续脱气，多用于低压梯度 色谱泵的排气操作色谱泵的排气操作 使用前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要 按以下步骤排气： .将排液阀反时针转2-3圈，用10ml注射器抽，直到出液 .按以下方法之一将泵的后面放空 将U6K的C阀打开，或717设在PURGE状态 或，将参比阀打开 或，把色谱柱摘下 .打开电源开关 .开大流速到 6

3、9ml/min .同时用10ml注射器从排液阀注入流动相 .直到泵后的流速稳定无气泡为止 色谱泵的运行色谱泵的运行 注意用外部控制器与用泵面板控制的区别 .有些型号的外部控制器与面板不能同时用 .如需要面板控制，需要断开控制线或关闭控制器 排气后的色谱泵即可运行 .注意 排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如 进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 液相色谱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相的要求外，还有 .与检测器匹配 .脱气 .避免卤素离子（不锈钢系统） .溶剂的粘度 .防止细菌的生长 流动相的保存流动相的保存

4、有机溶剂流动相: .室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: .当日现配现用 .低温下密封保存,一般不超过3天 .防止长菌 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: .低温密封保存 .防止有机相的挥发 选用适宜的容器 2 星期 1 天 1 星期 1 小时 新鲜配制 510152025 0 分 保存于聚乙烯瓶中的超纯水保存于聚乙烯瓶中的超纯水 1 天 1星期 新鲜配制 5101520250 分 保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水 检测器的保养检测器的保养 如长时间不用检测器可以关掉紫外灯 .在4小时以上不用时，太频繁开关也不好 不要让缓冲液长期停滞在检测池内 .用纯水冲洗 示差

5、检测器及荧光检测器 .注意流动池的耐压，不要在后面加压 关于自动进样器的针清洗关于自动进样器的针清洗 .Purge Injector 与 Needle Wash .洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus 的上部，应放于717plus同一水平面 .洗针溶剂根据流动相的不同应有不同： 流动相洗针溶剂 缓冲溶液，反相50% 水 50% 甲醇 纯缓冲溶液100% 水 非水溶液，反相100% 甲醇 正相流动相 GPC 流动相 离子交换对离子试剂的水溶液 异丙醇异丙醇？ 液相色谱系统的清洗与钝化液相色谱系统的清洗与钝化 一般采用30磷酸作为清洗剂，用6M硝 酸作为钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是

6、去除不锈钢管路及系统内的 污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成 光滑均匀的氧化膜 高效液相色谱的维护与保养高效液相色谱的维护与保养 色谱柱的使用及保养 测柱效测柱效 良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 色谱测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽 测柱效的方法测柱效的方法 色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书, 可按说明书所述方法测定 以下是Waters反相C18柱的测定方法: .流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min .样品:50mg

7、 Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml 乙腈,加入600l丙酮 .进样量5l .检测波长:254nm 计算色谱柱的柱效计算色谱柱的柱效 N N 理论塔板数计算公式： Ws 方法 Wtan16切线法 Wh5.54半峰高半峰高 W3s9 3s W4s16 4s W5s25 5s 2 1 W V Ns 色谱柱的正确使用及操作色谱柱的正确使用及操作 流动相的转换 .特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min .凝胶柱（GPC及糖柱） 温度的变化幅度 专用色谱柱 样品及溶剂的要求 记记住住拿拿到到一一根根从从未未用用过过的的色色谱谱柱柱时时 一一定定要要先先看看其其使使用用说

8、说明明！ 色谱柱与仪器的联接色谱柱与仪器的联接 不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时会造成 严重后果： .色谱峰展宽（死体积）致使柱效下降或渗漏 解决办法： .自制相应的转换接头 .使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth长度可调 。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接 头,可用在各种类型的色谱柱上。 色谱柱的联接色谱柱的联接 各种锥箍和管路接头长度示意图: 谱带展宽谱带展宽 连接适当 连接不妥 由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题 色谱柱安装及连接的机械因素

9、色谱柱安装及连接的机械因素 连接不妥，造成漏液 色谱柱的在线保护装置色谱柱的在线保护装置 给色谱柱提供物理的保护 .除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 .防止分析柱被化学污染 装置 .在线过滤器 .自装填料保护柱 .预装保护柱 在线过滤器在线过滤器 In-Line Filter，部件号 WAT084560 .防止颗粒在色谱柱头累积 .优点：基本不影响柱效 .在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸 分析） 可更换的消耗品 .更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) .更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs) 保护柱保护柱 可避免化学污染 新型保护柱可提

10、高整个色谱柱的柱效，甚 至可作为色谱柱使用 保护柱选择： 选用与色谱柱相同的填料 .真正起到保护作用 .保证色谱分离结果 使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析 相同保护柱与色谱柱：第950次进样 更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样 使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样 色谱柱的保护色谱柱的保护 色谱柱的清洗色谱柱的清洗 对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次 活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗 记住每种色谱柱可能有特定的方法记住每种色谱柱可能有特定的方法 一定要先看其使用说明！ 一定要先看其使用说明！ 色谱柱的存放色谱柱的存放 存放前的处理 .除去杂质、缓冲盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干涸 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度 正确使用色谱柱（一）正确使用色谱柱（一） 流动相方面 .除去微粒 .纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的