选修一5.3血红蛋白的提取和分离

1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 2003年年4月月14日宣布人类基因组序列图完成日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。 人类基因组：指人类基因组：指DNA分子所携带的全部分子所携带的全部 遗传信息。遗传信息。 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的 总和。主要是对蛋白质功能的研究总和。主要是对蛋白质功能的研究 n n 新华网首尔月日电（记者新华网首尔月日电（记者 干玉兰）韩国浦项工干玉兰）韩国浦项工 业大学科学家日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感业大学科学家日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒

2、感 染的染的“”蛋白质核心部分的结构。蛋白质核心部分的结构。 n 浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了 “”蛋白质内核心部分蛋白质内核心部分“” 的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与 其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期分子分子 细胞细胞杂志上。杂志上。 n 2年英国年英国自然自然杂志曾刊登论文说，杂志曾刊登论文说，“ ”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各

3、 地的很多科学家开始研究地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构，但蛋白质的结构，但 到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。 我国对蛋白质的现阶段研究 n n 我国独立主持国际我国独立主持国际“人类肝脏蛋白质组人类肝脏蛋白质组 计划计划”，参加国际人类蛋白质组研究计划中的，参加国际人类蛋白质组研究计划中的 “大规模抗体制备大规模抗体制备”项目项目 n 血血 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。呈红色

4、。 凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理 思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。 思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差

5、异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）： 2、凝胶：、凝胶： 一些微小多孔的球体（由多糖类构成如一些微小多孔的球体（由多糖类构成如 葡聚糖、琼脂糖，内含许多贯穿的通道葡聚糖、琼脂糖，内含许多贯穿的通道) 1、概念：根据被分离物质的蛋白质相对、概念：根据被分离物质的蛋白质相对 分子质量的大小，利用具有

6、网状结构的凝分子质量的大小，利用具有网状结构的凝 胶来进行分离。胶来进行分离。 3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（对（ ）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（ ），移动速），移动速 度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白）的蛋白 质无法进入凝胶内部的通道，只能在质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动速），移动速 度（度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因），相对分子质量不同的蛋白质因 此得以分离。此得以分离。 4、具体过程、具体过程 相对分子质量较小相对分子质量较小 较长

7、较长 较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大 凝胶外部凝胶外部 较短较短 较快较快 凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）的对溶液）的对溶液 的（的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变基本不变。 外界的酸或碱外界的酸或碱 PH值值

8、 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（就可以制得（ ）使用的）使用的 缓冲液。缓冲液。 12 使用比例使用比例 在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 电泳：电泳： 1、概念、概念：指带电粒子在电场作用下发指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程。生迁移的过程。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的目

9、的是利用缓冲液模是利用缓冲液模 拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正 常结构和功能，便于观察常结构和功能，便于观察（红色）（红色）和材和材 料的科学研究（料的科学研究（活性）活性） 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如 （ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下，这些基团会带上下，这些基团会带上 （ ） 。在电场的作用下，这些带。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其（电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （ ）以及分子本身）以及分子本身 （ ）、（）、（ ）的不同

10、使带电分子）的不同使带电分子 产生不同的（产生不同的（ ），从而实现样），从而实现样 品中各种分子的分离。品中各种分子的分离。 多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团 正电或负电正电或负电 所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极 带电性质的差异带电性质的差异 大小大小 形状形状 迁移速度迁移速度 一定的一定的PH 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。 由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用 下会解聚成单条肽链下会解聚成单条肽链，因此测定

11、的结果只是因此测定的结果只是 ( )。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质 形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带所带负电荷负电荷的的 量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS 单条肽链的分子量单条肽链的分子量 分子的大小分子的大小 分类：分类： 琼脂糖凝胶电泳琼

12、脂糖凝胶电泳和和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定（测定（ ）通）通 常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀 酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 电泳检测结果电泳检测结果 思考思考 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便，便 于进行于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰

13、富便于核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于 提取血红蛋白。提取血红蛋白。 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步： 二二 实验操作实验操作 1.样品样品 血血 液液 血浆血浆 水分水分 固体物质固体物质 血浆蛋白血浆蛋白 无机盐无机盐 磷脂磷脂 葡萄糖等葡萄糖等 血细胞血细胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多） 血红血红 蛋白蛋白 （ ） 两个两个a a肽链肽链 两个两个一肽链肽链 共四条肽链共四条肽链90 n每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，可携带基团，可携带一一 分子

14、氧或一分子二氧化碳分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含。血红蛋白因含血红血红 素素而呈现红色。而呈现红色。 （一）样品处理（一）样品处理 n1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤： n目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝 固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆； 用生理盐水洗涤。用生理盐水洗涤。 n2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 n3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液： n离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏离心

15、分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏 斗分出红色透明液体。斗分出红色透明液体。 n4、透析：、透析： 红细胞的洗涤红细胞的洗涤 分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 脂类物质脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体 红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀暗红色沉淀 物物 （一）样品处理（一）样品处理 n1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤： n目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝 固；离心将血液分层，用胶头吸管

16、吸出黄色血浆；固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆； 用生理盐水洗涤。用生理盐水洗涤。 n2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 n3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液： n离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏 斗分出红色透明液体。斗分出红色透明液体。 n4、透析：、透析： n装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透）透 析。析。 透析过程 视频（3.38） （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 取长取长40厘米，内径厘米，

17、内径1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作： 打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，目尼龙纱包好， 插到玻璃管的一端插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不 彻底。彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位将上述三者按相应位 置组装成一个整体置组装成

18、一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。 A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75）。）。 B、代表意义：、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀 时吸水时吸水7.5克。克。 配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮 液。液。 A、固定：、固定：将色谱柱装置将色谱柱装置 固定在支架上。固定在支架上。B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性

19、的装将凝胶悬浮液一次性的装 填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装 均匀。均匀。注意注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡 会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 视频（2.14） 装填完毕后，装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用高的操作压下，用 300ml的的20mmol/l的的磷酸磷酸 缓冲液（缓冲液（pH为为7.0）充分充分 洗涤平衡洗涤平衡12小时，使凝胶小时，使凝胶 装填紧密装填紧密。1、液、液

20、 面不要低于凝胶表面，否面不要低于凝胶表面，否 则可能有气泡混入，影响则可能有气泡混入，影响 液体在柱内的流动与最终液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效生物大分子物质的分离效 果。果。2、不能发生洗脱液、不能发生洗脱液 流干，露出凝胶颗粒的现流干，露出凝胶颗粒的现 象象。 打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶

21、面。凝胶面。 加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如 果红色区带均匀

22、一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、 使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。 视频（6.30） （三）纯度鉴定（三）纯度鉴定 n使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电 泳。泳。 二、实验操作二、实验操作 n蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步： n（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋 白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。 n（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 n（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大 的杂质蛋白质除去。的杂质蛋白质除去。 n（4）纯度鉴定：通过）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 胶电泳鉴定。胶电泳鉴定。 视频（2.14） 练习巩固 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋 白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要 做的一步是做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结