实验十二金黄色葡萄球菌

1、 金葡菌镜下特征 检样检样25g(mL) +稀释液稀释液225mL，均质，均质 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 7.5%氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤） BHI肉汤和营养琼脂斜面肉汤和营养琼脂斜面 Baird-Parker平板，血平板平板，血平板 涂片染色涂片染色 361 ， 18h24h 结果报告结果报告 361 B-P平板平板18h24h或或45h48h 观察溶血观察溶血 血平板血平板 18h24h 典型菌落特征：典型菌落特征：黑色黑色, , 有光泽有光泽, , 突起菌落并突起菌落并 伴有透明圈，通常外层有清晰圈伴有透明圈，通常外层有清晰圈 三、实验器

2、材三、实验器材 n2 设备和材料设备和材料 n除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设 备和材料如下：备和材料如下： n恒温培养箱、冰箱、恒温培养箱、冰箱、 恒温水浴箱、恒温水浴箱、 天平、天平、 均质均质 器、器、 振荡器、无菌吸管：振荡器、无菌吸管：1 mL（具（具 0.01 mL 刻刻 度）、度）、10 mL（具（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及刻度）或微量移液器及 吸头、吸头、 无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量 100 mL、500 mL、 无无 菌培养皿、菌培养皿、 注射器：注射器：0.5 mL、 pH计或计或 pH比色比色 管或精密

3、管或精密 pH试纸。试纸。 n3 培养基和试剂培养基和试剂 n3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录 A中中 A.1。 n3.2 7.5 %氯化钠肉汤：见附录氯化钠肉汤：见附录 A中中 A.2。 n3.3 血琼脂平板：见附录血琼脂平板：见附录 A中中 A.3。 n3.4 Baird-Parker琼脂平板：见附录琼脂平板：见附录 A中中 A.4。 n3.5 脑心浸出液肉汤脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录：见附录 A中中 A.5。 n3.6 兔血浆：见附录兔血浆：见附录 A中中 A.6。 n3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录 A中中

4、 A.7。 n3.8 营养琼脂小斜面：见附录营养琼脂小斜面：见附录 A中中 A.8。 n3.9 革兰氏染色液：见附录革兰氏染色液：见附录 A中中 A.9。 n3.10 无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录 A中中 A.10。 四、实验内容及操作四、实验内容及操作 n金黄色葡萄球菌定性检验程序见图 5.1 样品的处理样品的处理 n称取称取 25 g 样品至盛有样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，的无菌均质杯内， 8000 r/min10000 r/min 均质均质 1 min2 min，或，或 放入盛有

5、放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠氯化钠 胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质 器拍打器拍打 1 min2 min。 n若样品为液态，吸取若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的氯化钠胰酪胨大豆肉汤的 无菌锥形瓶无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，振荡混匀。中，振荡混匀。 5.2 增菌和分离培养增菌和分离培养 n5.2.1 将上述样品匀液于将上述样品匀液于 36 1 培养培

6、养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌在。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤 中呈混浊生长，污染严重时在中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪氯化钠胰酪 胨大豆肉汤内呈混浊生长。胨大豆肉汤内呈混浊生长。 n5.2.2 将上述培养物，将上述培养物， 分别划线接种到分别划线接种到 Baird- Parker平板和血平板平板和血平板， 血平板血平板 36 1 培培 养养 18 h24 h。Baird-Parker平板平板 36 1 培养培养 18 h24 h 或或45 h48 h。 n5.2.3 金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，平板上， 菌落直径为菌

7、落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑，颜色呈灰色到黑 色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油 至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的 类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存 的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干 燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形

8、、光 滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌 落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落 进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.3 鉴定鉴定 n5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏 阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无 荚膜，直径约为荚膜，直径约为0.5 m1 m。 n5.3.2 血浆凝固酶试验：血浆凝固酶试验： 挑取、挑取、 Baird- Parker平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落1个或以上，

9、个或以上， 分别接种到分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面和营养琼脂小斜面， 36 1 培养培养18 h24 h。 n取新鲜配置兔血浆取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，放入小试管中， 再加入再加入 BHI培养物培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇，振荡摇 匀，置匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小时温箱或水浴箱内，每半小时 观察一次，观察观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管，如呈现凝固（即将试管 倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于 原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以 血浆凝固酶

10、试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的 肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂， 按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 n结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培养培养 18 h48 h，重复，重复 试验。试验。 样品稀释度样品稀释度 1010-2 典型菌落数典型菌落数66，646，6 用于做血浆凝固酶用于做血浆凝固酶 的菌落数的菌落数 55 血浆凝固酶阳性菌血浆凝固酶阳性菌 落数落数 44 样品稀释度样品稀释度 1010-2 典型菌落数典型菌落数 150，16018，16 用于做血浆凝固酶用于做血浆凝固酶 的菌落数的菌落数 55 血