酚法测定蛋白质含量

1、生物化学实验报告姓 名：学 号：专业年级：组 别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心一、 实验室规则1实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。2进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得 高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。3严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目 处理，应及时请教指导老师。4严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的 精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告 老师，不得擅自拆修。5取用试剂时必须“随开随盖”，“

2、盖随瓶走，”即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李 戴”，避免污染。6爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。7注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得 将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。8废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱， 必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。9以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失 败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时 上交。1

3、0实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归 置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁 卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。实验名称(Title of Experimetn)Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量实验日期(Date of Experiment)实验地点( Lab No.)合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(Total Score)教师签名(Signature)批改日期（Date）实验报告第一部分（ 预习报告内容） ：实验原理、实验材料（包括实验样品、主要试

4、剂、主要仪器与器材） 、实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项） ；评分 （满分 30 分）：】一、实验原理1921 年， Folin 首创 Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚 基）还原酚试剂（磷钨酸 -磷钼酸）起蓝色反应； 1951 年， Lowry 对此法进行了改进， 先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。 Folin- 酚试剂法主要包括 两步：第一步 双缩脲反应在碱性溶液中， 双缩脲（H2NOCNHCONH2）能与 Cu2+作用 ,形成紫色或紫红色 的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个 肽键 , 因此有

5、双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质 - Cu2+复合物。第二步 Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐 -磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物） 。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸 （ Tyr ） ，故 有此显色反应。即蛋白质 - Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷 钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白 质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出 待测

6、样品中蛋白质的含量。二、实验材料（一）样品健康人血清（稀释 300 倍）（二）试剂1牛血清白蛋白标准液（ 200 g/ml）准确称取牛血清白蛋白粉末 50.0mg，用 0.1mol/L NaOH 溶液润湿溶解， 加蒸馏水到 250ml。2碱性硫酸铜溶液碱溶液： Na2CO32g 溶于 100ml 0.1mol/L NaOH 中。硫酸铜溶液： CuSO4?5H2O 0.5g溶于 100ml 35mmol/L（1%）酒石酸钾钠中。使用前将与按 50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。使用时新鲜配制。3Folin-酚试剂在 2L 磨口回流装置内加钨酸钠（ Na2WO4?2H2O）100g，钼酸钠（ Na2M

7、oO4?2H2O） 25g，蒸馏水 700ml，14.68mol/L（ 85%）磷酸 50ml，浓盐酸 100ml，充分混合后用小火 回流 10h。冷却后，再加硫酸锂（ Li 2SO4?H2O） 150g，水 50ml，数滴（ 23滴）液体溴 （也可用 30%H2O2 68 滴代替），然后开口沸腾 15min ，驱除过量的溴（因溴气甚毒， 这一步应在通风橱中进行） ，冷却后加水至 1000ml，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色） ，可再加液体溴数滴，煮沸 15min，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）（三）仪器及器材 1 V-

8、1100分光光度计 2恒温水浴箱 3试管 6 支、试管架 4加样枪、加样枪架 5坐标纸三、实验步骤1反应取 6 支试管编号，按下表加入试剂，混匀。体系设空白管标管样品管试剂（ ml ）置12 3456牛血清白蛋白标准液 0.2 0.40.60.8样品液 0.5蒸馏水 1.00.8 0.60.40.20.52双缩向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2ml，混匀，室温放置10min脲反应a. 当 Folin- 酚试剂加到碱性的铜 -蛋白质溶液中后，必须立即混匀 （加一管混匀一管） ，使还原反应 发生在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏 之前。b. 每管重复测三次 A500值，求平 均值用于绘标准曲线。3Fol

9、in- 再加入 Folin-酚试剂 0.20ml, 2s 内迅速混 酚反应匀 a！40水浴 10min 后，冷却至室温。4比色 以 500nm波长比色，用 1 号管作空白， 测定 读取各管吸光度值 A500b。实验报告第二部分（ 实验记录 ）：主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规 格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和 作为查找成败原因的参考依据） ；实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变 化）；原始实验数据。 评分（满分 20 分）：XX】一、主要实验条件实验条件见第一部分。注意事项1干扰物质此法是在 Folin- 酚法的基础上引入双缩脲试剂

10、，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH 2,-CH2-NH 2,-CS-NH 2 以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如 Tris 缓冲剂以及 蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰 Folin- 酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含 有酚类及柠檬酸， 均对此反应有干扰作用。 而浓度较低的尿素 （约 0.5%左右），胍（0.5% 左右），硫酸钠（ 1%），硝酸钠（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇（ 5%），乙醚（ 5%）， 丙酮（ 0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若 所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠 氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较 高

11、，也需提高碳酸钠 氢氧化钠浓度 12 倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。2控制时间因 Lowry 反应的显色随时间不断加深， 因此各项操作必须精确控制时间。 即第 1 支 试管加入 2.0ml 碱性硫酸铜试剂后，开始计时， 1 分钟后，第 2 支试管加入 2.0ml 碱性 硫酸铜试剂， 2 分钟后加第 3 支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已 到 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.20ml Folin- 酚试剂， 1 分钟后第 2 支试管加入 0.20ml Folin-酚试剂， 2分钟后加第 3支试管，以此类推。 40水浴 10min，冷却后，每一分钟测定一管吸光值操作

12、问题及处理问题解析（1） 加入 Folin- 酚试剂后加入 Folin- 酚试剂后没有及时混匀或加入的量不准溶液呈现黄绿色确，偏多（ 2） 水浴后溶液呈无色Folin- 酚试剂在反应前已被破坏，原因是加入 Folin- 酚试剂后没有及时混匀，或水浴时间过长。实验现象1、加入 Folin- 酚试剂后溶液呈现蓝色，其中空白组蓝色较浅，标准管 25蓝色依次加深。三、实验数据1数据记录按照下表记录各管在 500nm 波长测得的吸光度值。测定次数各管吸光度值 A5002345610.2790.4680.6290.7200.15320.2820.4630.6280.7180.14930.2770.4560

13、.6240.7180.150各管平均值 A 5000.2790.4620.6270.7190.1512绘制标准曲线3结果计算血清蛋白浓度 （ g/ml） = 样品蛋白质浓度 2300代入方程，线性方程为： y=0.005x，将样品溶液（即 6 号试管）的吸光度（ 0. 就可得出样品浓度 X=18.2g/l即该样本中人血清蛋白浓度为 18.2 g/L,低于正常人平均值。（参考：正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L）。实验报告第三部分（ 结果与讨论）：结果（定量实验包括计算） ：应把所得的实验结 果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的 结果；讨论：不应是

14、实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。结论：简单 扼要，说明本次实验所获得的结果。 （包括思考题）。评分（满分 45 分）：XX】 一、 结果1.实验测得的人血清蛋白浓度为 18.2 g/L，较标准值低。二、讨论 本实验测得样本人血清蛋白浓度偏低，原因可能有： 1、样本人体较正常人体蛋白浓度偏低2、Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，试剂被还原影响实验结果3、读数、试剂加入时间不够精确4、分光光度计溶液管表面油渍、污秽较多影响对光波长的分析三、结论1.实验测得的人血清蛋白浓度为 18.2 g/L，较标准值低。 课后思考题1、试述 Folin- 酚试剂法的优点？Folin-酚试剂法较双缩脲反应灵敏，可以达到 g 级别，操作方便，实验重复 性好。2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？酸碱性干扰。 Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，而反应试剂是碱性的，