试验四-逆转录PCR-RT-PCR

1、实验四 -逆转录 PCR-(RT-PCR)实验四 逆转录 PCR (RT-PCR)【实验目的】1了解用逆转录 PCR法获取目的基因的原理。 2学习和掌握逆转录 PCR的技术和方法。【实验原理】 聚合酶链式反应( PCR)过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基 因的一种非常灵敏的技术。一般经 25-35 轮循环就可使模板 DNA扩增达 106 倍。 RT-PCR将以 RNA为 模板的 cDNA( complement DNA)合成(即 RNA的反转录( RT，reversetran

2、scription )，同 cDNA 的 PCR结合在一起的技术， 提供了一种基因表达检测、 定量和 cDNA克隆的快速灵敏的方法。 由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究， 因此 RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列。 RT-PCR比其他包括 Northern 印迹、 RNase保护分析、 原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR 的基本原理(

3、图 4.1 )。首先是在逆转录酶的作用下从 RNA合成 cDNA，即总 RNA中的 mRNA在体外被反向转录合成 DNA拷贝，因拷贝 DNA的核苷酸序列完全互补于模板 mRN，A 称之为互补 DNA( cDNA)；然后再利用 DNA聚合酶，以 cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸( dNTP)为材 料，在引物的引导下复制出大量的 cDNA或目的片段。在 RT时，有 3种引物可选择 (表 4.1) 。用 1)和 2)方法，理论上是扩增的所有的 cDNA， 还要用此产物做 PCR的模板继续扩增。如果用 3)方法，先要去 查它 的序列，并用

4、 oligo 等软件设计引物。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。 两步法 RT-PCR比较常见， 在使用一个样品检测或克 隆多个基因的 mRNA时比较有用。在两步法 RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。 cDNA的合成首 先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。而一步法 RT-PCR具有其它优点(表 4.2 )，cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得 到更高的灵敏度，最低可以达到 0.1pg 总 RNA，因为整个 cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法 RT-PCR，一般使用基因特异性引物 (GSP)起始

5、cDNA的合成。由图 4.1 不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点 退火，产生短的，部分长度的 cDNA。这种方法经常用于获取 5 末端序列及从带有二级结构区域或带 有逆转录酶不能复制的终止位点的 RNA模板获得 cDNA。为了获得最长的 cDNA，需要按经验确定每个 RNA样品中引物与 RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为 50到 250ng每 20l 反应体系。因为使 用随机引物从总 RNA合成的 cDNA主要是核糖体 RNA，所以模板一般选用 poly(A)+RNA。Oligo(dT) 起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端 所发现

6、的 poly(A) 尾杂交。因为 poly(A)+RNA 大概占总 RNA的 1%到 2，所以与使用随机引物相比， cDNA的数量和复杂度 要少得多。 因为其较高的特异性， oligo(dT) 一般不需要对 RNA和引物的比例及 poly(A)+ 选择进行优 化。建议每 20l 反应体系使用 0.5 g oligo(dT) 。 oligo(dT)12-18 适用于多数 RT-PCR。 基因特异性引物( GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。 GSP是反义寡聚核苷，可以特 异性地同 RNA目的序列杂交， 而不象随机引物或 oligo(dT) 那样同所有 RNA退火。用于设计 PCR引物 的规

7、则同样适用于逆转录反应 GSP的设计。 GSP可以同与 mRNA 3最末端退火的扩增引物序列相同， 或 GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。已经制备好的双链 cDNA和一般 DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适 当的接头 (Linker) ，接头可以是在 PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经 PCR扩增后再克 隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚 dG和 dC或 dT 和dA尾巴,退火后形成重组质粒 , 并转化到宿主菌中进行扩增。本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas配体基因， Fas配体(FasL) 是一分子量约为 40

8、u的II 型跨膜糖蛋白，属 TNF家族成员。活化的 T细胞可表达 Fas和FasL，并通过 Fas/FasL 系统介导细胞 凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中 FasL 表达增强，并与肿瘤的 复发转移有关。我们采用 RT-PCR方法克隆 FasL 全长 cDNA并构建其表达载体，可以为进一步研究 FasL 的功能提供条件。 在上下游引物的 5端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基 (即 Hind III 和 BamH I )，以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pGFPUv上(附录图 4.3 )。为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋

9、白， 我们改造了 pGFPU，v 在 其上加了 6 His 标签。【试剂与器材】(一)试剂1. 总 RNA(或 mRN)A 2.RNA酶抑制蛋白( RNase Inhibitor3.dNTP 混合物 ( 各 10 mM) 4.oligo(dT)12-18 ：2.5 mol/L5.10* 逆转录合成缓冲液(10 RTb uffer )：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) ，375 mmol/L KCl MgCl26.AMV逆转录酶 5u/ L7. 基因特异性 5和 3引物各 20 mol/L8.Tap DNA 聚合酶 5u/ L9.10*PCR缓冲液： 500mmol/L K

10、Cl ，100mmol/L Tris ?Cl，在 25下， pH9.0，1.0% Triton 15mmol/L MgCl2。) ： 40 U/mL15 mmol/LX-100 ，（二）器材1）PCR仪，2）PCR管，3）微量移液器操作方法】 一）逆转录：1）建立 RT反应体系：2）涡旋混匀， 42反应 1小时， 95加热 5分钟，然后置于冰上。（二） PCR扩增：1）建立 PCR反应体系：2） 将上述反应体系涡旋混匀 , 按下列程序运行循环：step2-4 运行 30 个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。（三）取 10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的 PCR产物

11、-20 保存。【注意事项与提示】1. 逆转录反应过程，需建立无 RNAase环境，以避免 RNA的降解。2. 成功的逆转录反应决定于高质量的模板 RNA。高质量的 RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑 制剂，如 EDTA或 SDS。此外， RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是 RNA中沾染的基因组 DNA。使用较 好的 RNA分离方法，如 Trizol Reagent ，会减少 RNA制备物中沾染的基因组 DNA。因此在进行 PCR 反应时应该对每个 RNA模板进行一个无逆转录的对照反应， 以确定扩增出来的片段是来自基因组 DNA 还是 cDNA。在无逆转录时所得到的 PCR产物来源于基因

12、组。3. RT-PCR的起始模板可是总 RNA或 mRN，A 都可以检测到扩增结果（如下图） 。另外，分离 mRNA会导 致样品间 mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有基因时，使 用 mRNA会增加检测的灵敏度。4. 在逆转录反应中经常加入 RNA酶抑制蛋白以增加 cDNA合成的长度和产量。 RNA酶抑制蛋白要在第 一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA合成前的过程会使抑 制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA的 RNase。RNA酶抑制蛋白仅防止 RNase A，B，C对 RNA的 降解，并不能防止皮肤上的 RNa

13、se，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上 Rnase 对样 品的污染。5. 较高的保温温度有助于 RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数 RNA模板，在没有缓 冲液或盐的条件下，将 RNA和引物在 65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构， 从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模 板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶， 如： Invitrogen 公司的 ThermoScript 逆转录酶， 使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR的特异性。6. 建立反应体系

14、时，加完其它反应物后，才加模板 DNA和 Taq DNA聚合酶；然后将全部反应物涡旋 混匀；上 PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。7. PCR反应的循环数一般 25-30 次就足够了， 过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。 复性 温度的计算，一般是在引物的 Tm值上下浮动， Tm= 2（A+T）+4（ G+C）。适当提高复性温度可提高 PCR 扩增的特异性。8. 不管是反转录反应还是 PCR反应都应先调制试剂的 Master Mix （ 包括 RNase Free dH2O、缓冲液、 dNTPM ixture 等） ，然后分装到每个反应管中。 这样可使所取的试剂的体积更准确， 减少试剂的

15、损失， 避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。而且分装试剂时务必用新Tip ，以防止样品间的污染。9. AMV、RNaseI nhibitor 、Taq 等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。分取之前要轻轻地离心收集到反 应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从 -20 取出，使用后立即放回 -20 保存。10. 最佳的 PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同， 所以在使用您的样品之前最好先做 Control 反应， 以确定最佳的 PCR条件。为延长 PCR仪的使用寿命，应尽可能缩短 PCR仪 4保存的时间，尽量避免 4过夜的情况。Lane 1 ：总 RNA 的 RT-PCR 产物（人细胞调亡因子 TF15基因）Lane 2 ： mRNA 的 RT-PCR 产物，人细胞调亡因子 TF15 基因L