代谢设计育种

1、 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）2 1 代谢代谢设计育种的策划设计育种的策划 2 育种方案的实施育种方案的实施 代谢设计育种代谢设计育种 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）3 1. 代谢设计育种的策划代谢设计育种的策划 1.1 目的产物代谢途径的组合目的产物代谢途径的组合 （五段式）（五段式） 1.2 中心代谢流上节点的分析中心代谢流上节点的分析 1.3 理想载流途径的推定理想载流途径的推定 1.4 五字策略的应用五字策略的应用 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）4 1.1 目的产物代谢途径的组合目的产物代谢途径的组合 （五段式）（五段式） 目的产物合成代谢的目的产

2、物合成代谢的“五段式五段式” 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）5 1.2 中心代谢流上节点的分析中心代谢流上节点的分析 代谢网络上的交叉点（代谢中代谢网络上的交叉点（代谢中 间化合物）叫做代谢网络的节点。间化合物）叫做代谢网络的节点。 节点有刚性和挠性之分。挠性节点节点有刚性和挠性之分。挠性节点 处的流量分配容易发生改变，任何处的流量分配容易发生改变，任何 分支可以得到分支可以得到 100% 的流量。刚性的流量。刚性 或弱刚性节点的流量分配比例不容或弱刚性节点的流量分配比例不容 易发生改变。易发生改变。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）6 ss p1p1p2p2 p1 i

3、p1 ip2 i p2 i p1 a p2 a 强刚性节点强刚性节点 弱刚性节点弱刚性节点 优优 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）7 尽管代谢网络包含了大量的节点，尽管代谢网络包含了大量的节点， 但通常只有几个节点直接影响产物的转但通常只有几个节点直接影响产物的转 化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来 说，有五个分支点处流量的分配率受到说，有五个分支点处流量的分配率受到 培养条件较大的影响，它们是培养条件较大的影响，它们是 g-6-p、 f-6-p、pep、pyr 及及oaa。 在这些分在这些分 支点中，只有支点中，只有g-6-p 和和 pep / p

4、yr， 被被 认为是有用的主要节点。通过认为是有用的主要节点。通过扰动节点扰动节点 处代谢流量的方法可以做出判断。处代谢流量的方法可以做出判断。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）8 pep pyroaa g6p 挠性节点挠性节点 刚性节点刚性节点 赖氨酸生物合成的网络结构推测试验赖氨酸生物合成的网络结构推测试验 lys accoa pyrext f6p glcga6p 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）9 网络刚性是自然选择的结果，是网络刚性是自然选择的结果，是 细胞经济体系的保障作用的体现。刚细胞经济体系的保障作用的体现。刚 性节点是由反馈调节和交叉激活等代性节点是由反馈调

5、节和交叉激活等代 谢自动调节机制来支持的，谢自动调节机制来支持的，解除调节解除调节 可望改变节点的性质。可望改变节点的性质。然而，代谢自然而，代谢自 动调节机制不但包括反馈调节和交叉动调节机制不但包括反馈调节和交叉 激活。激活。刚性节点的支持背景刚性节点的支持背景尚未弄清尚未弄清 的时候，只好绕过该刚性节点，先解的时候，只好绕过该刚性节点，先解 决其它节点的问题。决其它节点的问题。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）10 根据文献和实验推测。实验包根据文献和实验推测。实验包 括离线推定和在线推定。括离线推定和在线推定。 1.3 理想载流途径的推定理想载流途径的推定 2021-6-13张

6、星元：发酵原理（讲座）11 npp 进进出出通通节节堵堵 1.4 五字策略的应用五字策略的应用 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）12 节点的刚性取决于微生物代节点的刚性取决于微生物代 谢的自动调节机制。因此在应用谢的自动调节机制。因此在应用 “ 五字策略五字策略 ” 制订育种方案时制订育种方案时 必须认真分析代谢网络和节点的必须认真分析代谢网络和节点的 刚性及其形成的机理，尽量采用刚性及其形成的机理，尽量采用 协调（如：调节突变株）而不是协调（如：调节突变株）而不是 一刀切（如：营养缺陷型突变株）一刀切（如：营养缺陷型突变株） 的手段。的手段。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲

7、座）13 2 育种方案的实施育种方案的实施 2.1 出发菌种的选定出发菌种的选定 2.2 遗传操作方案的制定遗传操作方案的制定 2.3 遗传操作方案的实施遗传操作方案的实施 2.4 变异株培养条件的优化变异株培养条件的优化 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）14 调节机制简单：文献调节机制简单：文献 遗传标记可靠：文献，实验遗传标记可靠：文献，实验 生长情况良好：实验，观察生长情况良好：实验，观察 有目的产物的生产潜力：哲学思辨有目的产物的生产潜力：哲学思辨 可以获得可以获得 经费方面可行经费方面可行 2.1 出发菌种的选定出发菌种的选定 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）15

8、 物理诱变物理诱变 化学诱变化学诱变 复合诱变复合诱变 定向诱变定向诱变 插入基因拷贝插入基因拷贝 插入途径基因组插入途径基因组 2.2 遗传操作方案的制定遗传操作方案的制定 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）16 缺陷型突变株的获得缺陷型突变株的获得 结构类似物抗性突变株的获得结构类似物抗性突变株的获得 结构类似物超敏性突变株的获得结构类似物超敏性突变株的获得 分子生物学方法（略）分子生物学方法（略） 2.3 遗传操作方案的实施遗传操作方案的实施 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）17 营养因子、酶和功能性蛋白质营养因子、酶和功能性蛋白质 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株营养缺陷

9、与渗漏营养缺陷突变株 酶缺损突变株酶缺损突变株 输送体系缺损突变株输送体系缺损突变株 条件突变株条件突变株 突变株的获得突变株的获得 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）18 （1）营养因子：氨基酸、维生素、嘌）营养因子：氨基酸、维生素、嘌 呤和嘧啶（经离心途径合成）。呤和嘧啶（经离心途径合成）。 （2）酶：）酶： 中心代谢途径的酶中心代谢途径的酶 （ 特别特别 是与生长密切相关的酶是与生长密切相关的酶 ）、）、 向心途径向心途径 的酶、离心途径的酶。的酶、离心途径的酶。 （3）功能性蛋白：调节酶、专一性的）功能性蛋白：调节酶、专一性的 输送蛋白、调节蛋白、输送蛋白、调节蛋白、 以及以及

10、 电子传递电子传递 链的多肽成员、链的多肽成员、atp 酶等。酶等。 营养因子、酶和功能性蛋白质营养因子、酶和功能性蛋白质 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）19 （1）营养缺陷突变株）营养缺陷突变株 （2）渗漏营养缺陷突变株）渗漏营养缺陷突变株 mm mm+fcm 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出 无营养缺陷无营养缺陷 其他营其他营 养缺陷养缺陷 f营养缺陷营养缺陷 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）20 结构类似物（代谢撷颃物）的选择：结构类似物（代谢撷颃物）的选择： 一、空间结构类似，一、空间结构类似， 二、对微生物有致死性或毒性（抑二、对

11、微生物有致死性或毒性（抑 制生长）；绝大多数情况下，结构类似制生长）；绝大多数情况下，结构类似 物可被其物可被其“真身真身”解毒。解毒。 三、有些抗生素、药物（包括中三、有些抗生素、药物（包括中 药）、诱变剂本身就是结构类似物（代药）、诱变剂本身就是结构类似物（代 谢撷颃物），但需确证。谢撷颃物），但需确证。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）21 结构类似物的确定结构类似物的确定 生长抑制试验和敏感性试验生长抑制试验和敏感性试验 “筛子筛子”的设计的设计 剂量的确定剂量的确定 筛选的具体方法的确定筛选的具体方法的确定 高产株的检出高产株的检出 结构类似物抗性突变株的获得结构类似物抗性

12、突变株的获得 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）22 结构类似物的确定及其抗性突变株的检出结构类似物的确定及其抗性突变株的检出 a a a 对照对照实验（纸片法）实验（纸片法） 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）23 生长抑制试验和敏感性试验生长抑制试验和敏感性试验 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）24 （1）根据反馈调节机制设计）根据反馈调节机制设计 （2）同时要考虑协同调节机制等）同时要考虑协同调节机制等 （3）要考虑实验的成本问题）要考虑实验的成本问题 （4）根据问题的轻重缓急设计）根据问题的轻重缓急设计 “筛子筛子”的设计的设计 2021-6-13张星元：发酵

13、原理（讲座）25 （1）浓度梯度平板筛选法）浓度梯度平板筛选法 （2）纸片法）纸片法 （3）液体培养浓缩后涂布的方法）液体培养浓缩后涂布的方法 （4）其他方法）其他方法 筛选的具体方法的确定筛选的具体方法的确定 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）26 （1）反馈调节的调节突变株：抗性）反馈调节的调节突变株：抗性 （2）输送体系突变株：抗性）输送体系突变株：抗性 （3）影响与底物的亲和能力的突）影响与底物的亲和能力的突 变株：超敏性变株：超敏性 （4）对入围的突变株进行产量形状）对入围的突变株进行产量形状 的筛选的筛选 高产株的检出高产株的检出 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）

14、27 尽量从生物学的角度安排试验尽量从生物学的角度安排试验 尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条 件不一致带来的系统误差件不一致带来的系统误差 每批摇瓶（生物）试验都要做对照每批摇瓶（生物）试验都要做对照 注重产量与菌体量之间的的微妙注重产量与菌体量之间的的微妙 关系（生物机器的特殊性）关系（生物机器的特殊性） 2.4 变异株培养条件的优化变异株培养条件的优化 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）28 对于发源于农产加工和农业化学的对于发源于农产加工和农业化学的 手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁 重的体力劳动，就必须走工业化的道

15、路。重的体力劳动，就必须走工业化的道路。 于是，发酵生产首先向化学工业靠拢，于是，发酵生产首先向化学工业靠拢， 通过向化学工程学习，用泵和管道输送通过向化学工程学习，用泵和管道输送 替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生 产代替了手工操作，早已把作坊式的发产代替了手工操作，早已把作坊式的发 酵生产成功地推上了工业生产的水平。酵生产成功地推上了工业生产的水平。 发酵生产与化学工程的结合促成了发酵发酵生产与化学工程的结合促成了发酵 生产的第一次飞跃生产的第一次飞跃。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）29 生产实践已经证明工业发酵过程是生产实践已经证明工业发酵

16、过程是 一个随着时间变化的（时变的）、非线一个随着时间变化的（时变的）、非线 性的、多变量输入和输出的动态过程，性的、多变量输入和输出的动态过程， 按照化学工程的模式处理工业发酵的问按照化学工程的模式处理工业发酵的问 题，微生物细胞屈居于催化剂的地位，题，微生物细胞屈居于催化剂的地位， 难以发挥其生产潜力。难以发挥其生产潜力。十多年来，我们十多年来，我们 从研究微生物的生命活动规律入手，从研究微生物的生命活动规律入手，把把 现代生物学关于能量转换的电子流动、现代生物学关于能量转换的电子流动、 物质流动和信息流动这三个基本观点引物质流动和信息流动这三个基本观点引 入了工业发酵入了工业发酵，重新审

17、视发酵工程。，重新审视发酵工程。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）30 用生物学的眼光重新审视发用生物学的眼光重新审视发 酵工程，确认了发酵工程的生物酵工程，确认了发酵工程的生物 学属性。从生物科学的高度在发学属性。从生物科学的高度在发 酵工程领域首先提出了酵工程领域首先提出了微生物细微生物细 胞机器胞机器的新概念和新思路。的新概念和新思路。 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）31 （1）现代发酵工程依靠微生物来完成）现代发酵工程依靠微生物来完成 发酵工厂生产线上的不可缺少的加工发酵工厂生产线上的不可缺少的加工 （或转化）步骤，在这个意义上，微生（或转化）步骤，在这个意义上，

18、微生 物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少 的特殊机器的特殊机器微生物微生物“细胞机器细胞机器”。 因而，没有微生物就没有发酵工程，没因而，没有微生物就没有发酵工程，没 有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂。有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂。 微生物是发酵工程的灵魂。微生物是发酵工程的灵魂。 我们认为：我们认为： 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）32 （2）微生物细胞机器与普通意）微生物细胞机器与普通意 义上的机器不同，必须在生产线义上的机器不同，必须在生产线 上完成细胞机器的上完成细胞机器的“在线制造在线制造” 和和“生产运行生产运行”的双重任务，因的双重任务，因 而，必须兼顾细胞机器的量和细而，必须兼顾细胞机器的量和细 胞机器的工作效率。胞机器的工作效率。 我们认为：我们认为： 2021-6-13张星元：发酵原理（讲座）33 （3）微生物细胞机器按其自身）微生物细胞机器按其自身 固有的规律运行，因而，