电泳常见问题解答

1、1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris HCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7，分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用 的 Tris 甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此 甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子却很 高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起， 浓缩为一狭窄的区带。 当样品进入分离 胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增 加，直接紧随氯离子之后，

2、同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作 用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排 除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处 理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS处理。1）还原 SDS处理：在上样 buffer 中加入 SDS和 DTT（或 Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白 相结合的分子，在电泳中， 只根据分子量来分离。一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度， 加入上样

3、 Buffer ，离心，沸水煮 5min， 再离心加样。2）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的 DTT ，而防止银染时的纹理现象。 100ul 样品缓冲液 中 10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温 30min 。3）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只 用 1SDS沸水中煮 3min，未加还原剂， 因而蛋白折叠未被破坏， 不 可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用： 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体， 其凝 固的好坏直接

4、关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 tris HCL系统， TEMED与AP：AP提供自由基， TEMED 是催化剂， 催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（ SDS）：阳离子 去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般 凝胶可在室

5、温下保存 4 天， SDS 可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染 料又各自不同的染色方法， 具体可参照郭尧君编著的 蛋白质电泳技 术手册 P82-103。5. “ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致， 多出现于较厚的 凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离

6、心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时， 常会出现在泳道 顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性， 致使原来被解离 的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合， 聚合成大分子， 其分子 量要比目标条带大， 有时不能进入分离胶。 但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗

7、体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未 跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer ；降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正 确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。 比如电压 50

8、v 以上，可电流却在5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包 括：a.内外槽装反； b.外槽液过少； c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比 如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中， 一般对电泳不会有太大的影响。 前者 主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致； 后者是由于在解除制胶的 夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED ， APS剂量不够或者失效。 APS 应该现配现用， TEMED

9、不稳定，易被 氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此 时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓 冲系统地 PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强 度太高。 我们实验室的传统也是将倒完的胶放在冰箱内过夜凝聚， 第二天跑胶 效果非常好。我想主要原因并不在于低温，而在于过夜时间长，让胶 凝聚得非常充分而且均匀。反之，在 37 温箱内虽然凝得很快，但是 容易出现胶脆，凝聚不均匀等情况。我想只要你得配液没问题，那么 适当延长凝胶时间肯定效果会好些！ 温度的高低决定了胶聚合的速度：高

10、温有助于胶的聚合。但是，胶聚 合得越快，其脆性也越大。因此，一般把胶的聚合时间控制在 40-60 分钟左右为宜。当然，灌胶后放入 4 度聚合，其聚合时间会大大延长， 但是其脆性也会大大降低 上层的浓缩胶用的是 Tris-HCL 缓冲液， PH6.8， HCL 的解离度大， 几乎全部成 CL- ， CL-在电场中移动最快。而电泳槽中含有甘氨酸，在 PH6.8 时只有少 量解离，在电场中移动的最慢。 蛋白质（被夹在中间）就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了。下层的分离胶用的是 Tris-甘氨酸缓冲液， PH8.8，在此 PH 下，甘 氨酸解离度增大，泳动速度增加并超过了蛋白质， 原先的电位梯度消

11、失， 大小形状不同 的蛋白质在电场中分离。电泳结果的好坏肯定和电泳的条件有关 ,我认为应该注意以下几点 : 1,样品的纯度高 ,杂质含量少 ,选择的 Loading 要正确 ;2, 就是胶的浓度要控制好 ,看你跑的条带大小来选择胶的浓度 ,特别是 分离胶的浓度 !3, 就是电压的选择 ,当样品在浓缩胶里时 ,可以把电压调小点 ,当到分离 胶时 ,电压可以加大 ,这样跑的条带就清晰 !4, 点样品的量要控制好 ,不能太多 ,否则就跑成团状 ,也不能太少 ,条带 不清晰!至于样品和 Marker 显色问题 ,那要看你用的 Marker 是预染 Marker 还 是非预染 Marker,如果用的是预

12、染 Marker,那就是跑胶时 ,Marker 条带 先显现出来 !如果是非预染 Marker,那条带就和样品一起染色时显现出 来!SDS-PAGE经验集锦：极其好用 2009-06-28 00:17蛋白 SDS-PAGE电 泳及定量在蛋白质技术手册 5 基础上，根据实验条件的方便修改。 请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室 5 年验证。【一】 储存液配制（注意配方和实际测定参数！ ！）（1）2 M Tris-HCl （ 实测 pH 8.9 0.1， 25） 500 mL：121 g Tris base 加 350 mL 双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约 1 min，缓慢加入浓盐酸 （11.

13、8 M）20 mL，继续搅拌均匀，并使 Tris 全部溶解，溶液澄清，加入适 量双蒸水至 500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱保存。 （2）100 g/L SDS 溶液： 10 g SDS （要求高纯度，其质量明显影响 电泳效果）加 100 mL 双蒸水，于洁净的 250 mL 烧杯中进行微波加 热溶解，注意不要爆沸，间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解，完全溶解后 的溶液应清澈透明无色。倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱保存。冰 箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。（ 3）75%（v/v）甘油：于 500 mL 量筒中倒入分析纯甘油 300 mL， 加双蒸水 100 mL ，以一次性塑料手套封口，

14、颠倒量筒使甘油完全溶 解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱保存。（4）10 g/L 溴酚蓝溶液： 500 mg溴酚蓝加双蒸水 50 mL，搅拌溶解， 倒入棕色玻璃试剂瓶中， 4 冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上 层澄清液，不要吸到沉淀。【二】电泳工作液配制（省劲好用！ ！）（ 1）Acr-Bis 液（丙烯酰胺溶液） 500 mL：于 800 mL 洁净的烧杯中， 依次称取双丙烯酰胺 4 g，丙烯酰胺 146 g，缓慢倒入双蒸水约 350 mL， 以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。 注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中， 所以要称重时注意周围空气流速， 称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双 丙烯酰胺掩盖。玻

15、璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺 浮起并扩散到空气中。 完全溶解的溶液应清澈无色透明。 待溶解完全 后补加双蒸水至 500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱可保存 10 个月。2）4分离胶缓冲液， 500 mL：于 500 mL 洁净的量筒中，依次加 入 375 mL 2 M Tris-HCl （ 实测 pH 8.9 0.1，25 ）， 100 g/L SDS 溶 液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化） 20 mL，最后加入适 量双蒸水至 500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱最少可保存 12 个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊， 微波略微加热使其澄清后 即可使用。

16、（ 3）100 g/L 过硫酸铵溶液 （ammonium persulfate, AP）20 mL：2g 过 硫酸铵加 20 mL 双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中， 4冰箱最少可保 存 10个月。注意配胶时不要交叉污染 TEMED ，可以以 5 mL 分装到 4 个无色塑料试剂瓶中分别保存。（4）TEMED 成品液：购买后分装成 2 或 5 mL 小管装使用可避免母 液受到污染。（5）5样品缓冲液， 100 mL：依次加入 50 mL 75% （v/v）甘油， 20 mL 100 g/L SDS 溶液， 10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液， 5 mL 2 M Tris-HCl （实测 pH8.

17、9 0.1，25），5 mL 巯基乙醇， 9 mL 双蒸水。 混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中， 4冰箱至少可保存 12 个月。可分 装成 10 mL 使用，不会使母液受到蛋白污染。（ 6）10电泳缓冲液， 1000 mL： 称取 10 g SDS，30 g Tris base， 144g 甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色 的产品）于 1000 mL 的烧杯中，加水约 700 mL 溶解，可微波炉加热 （ 80）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可， 间歇用玻璃棒搅拌。 分装至无色玻璃试剂瓶中， 室温最少可保存 6 个 月。其 pH 值约为 pH 8.40.1。【

18、注意可省去 pH6.8的浓缩胶缓冲液，用 4分离胶缓冲液 pH8.9 的替代即可】【三】 12% 电泳胶的配制 要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分 离胶的小烧杯内， 以枪头搅拌约 10-20 sec，灌胶后再在胶面上小心地 铺上一几毫米厚的水层 （这可使凝固后的胶面平滑整齐） ，然后于 37 凝固 15-30 min。而在配胶时浓缩胶只加前三个组分， 混合液要于 4 冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入 AP 和 TEMED 溶液，枪头搅拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于 37凝固 15-30 min。凝固的胶连带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密包裹可在4冰箱保存 2-4 天，

19、长时间保存易干胶，要重新做胶。12.5% 电泳胶的配制（ 10mL）Table 12.5% Gel componentsReagentsCondensing gel二块30% Acr-Bis solution0.67 mL4seperating gel buffer 2.5 mL pH8.9H2O 3.5 mLSeperating gel4 mL1mL pH8.92.3 mL100 g/L AP50 L30L5L4块 30% Acr-Bis solution 1.35 mL4seperating gel buffer pH8.9 H2O 100 g/L AP100 LTEMED 六块 30%

20、Acr-Bis solution12 mL4seperating gel buffer H2O5 mL pH8.97 mL7.5 mL pH8.910.5 mL100 g/L AP150 LTEMED8 mL2 mL4.6 mL60 L10 L 10 L2.1 mL3 mL pH8.97 mL90 L15 L155 LTEMED其他浓度的电泳胶配制A% 电泳胶的配制（ 10 mL）Table A% Gel components（ 10 mL）ReagentsSeperating gelCondensing gel二块30% Acr-Bis solution ( A% *10mL )0.67 m

21、L4seperating gel buffer 2.51 mL pH8.9H2O2.3 mL100 g/L AP30 LTEMED5 L/30% mLmL pH8.9补 足 10mL50 L其中的 H2O 补足 10mL，所用的计算公式为： 10mL-2.5mL- (A% *10mL ) /30% mL 。 例如 6%的配方中，30% Acr-Bis solution2 mLH2O 5.5 mL例如 12.5%的配方中，30% Acr-Bis solution4 mLH2O3.5 mL例如 15%的配方中，30% Acr-Bis solution5 mLH2O2.5 mL【四】 考马斯亮蓝染色和脱色（极其好用！ ！）考马斯亮蓝染色液 1000 mL： 先称取考马斯亮蓝 R250 1.0 g 于 1000 mL 试剂瓶内，加入甲醇 450mL 溶解，再加冰醋酸 1