消痰散结方对人结直肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的特征分析

1、消痰散结方对人结直肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的特征分析近年来结肠癌在我国的发病率呈明显上升趋势，发病率高居第3位，病死率为第5位【1】。中医药在恶性肿瘤防治中发挥着重要作用。消痰散结方是本院魏品康教授临床治疗消化道肿瘤40余年的经验方，前期研究表明，消痰散结方可有效提高中晚期消化道肿瘤患者的卡氏评分、延长生存期【2】。为深入研究消痰散结方的作用机制，本研究采用消痰散结方干预人结直肠癌HCT116细胞，观察其对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。1 材料与方法1.1 细胞株与细胞培养HCT116人结直肠癌细胞株，购自中国科学院上海生科院细胞库。培养条件为37 、5%CO2；培养基

2、为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Mccoys 5A培养基；用含0.01%EDTA的0.25%胰酶进行消化传代，待细胞处于对数生长期后，用于实验。1.2 药物消痰散结方由天南星、法半夏、全蝎、蜈蚣、鸡内金、茯苓、山慈菇、炙甘草等12味中药组成，中药饮片购自上海雷允上公司，本院制剂室水蒸醇提法制备浸膏，原药材浓度为3.35 g/mL。消痰散结方冻干粉末保存液制备：将消痰散结方浸膏在超净水中稀释5倍，16 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 制备冻干粉末，称重，溶解在细胞培养液中制备保存液， 0.22 μm膜过滤，保存液药物浓度为1

3、0 mg/mL（原药材浓度为0.22 g/mL）【3】。 1.3 主要试剂与仪器胎牛血清，奥地利PAA Laboratories GmbH公司；Mccoys 5A培养基，GIBCO公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂，日本Dojindo公司。RIPA裂解液（P0013B）、BCA试剂盒（P0010S），碧云天公司；兔抗人Caspase3一抗（Cat No.#9665），美国CST（Cell Singaling）公司；鼠抗人β-actin一抗（Cat No.66009-1-Ig）、HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG二抗（Cat No.SA00001-1

4、）、HRP标记的羊抗兔IgG二抗（Cat No.SA00001-2），美国Proteintech公司；ECL发光试剂盒，美国Thermo Scientific公司（Cat No.32109）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，南京凯基生物公司（Cat No.KGA7024）；Millicell EZ slide细胞培养板，美国Millipore公司（Cat No.PEZGS0816）。Thermo Forma CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司；SterilGard超净工作台，美国Baker公司；TS100倒置显微镜，日本Nikon公司；Model 550酶标仪，美国Bi

5、o-Rad公司；Model Universal Hood 凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。1.4 细胞分组与干预方法细胞分为空白组（不接种细胞）、对照组（接种细胞不加药物）及消痰散结方不同浓度组（0.187 5、0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 mg/mL组和0.47、0.94、1.88 mg/mL组），各浓度组6复孔，培养24、48、72 h。1.5 检测指标及方法1.5.1 CCK-8法细胞增殖检测 96孔培养板中接种细胞悬液（100 μL/孔，细胞浓度为5x104/mL），细胞分组、给药，置37 、5%CO2培养箱中培养72 h；每孔吸尽培养液，更换100 &mu

6、;L新鲜培养基，并加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育3 h，酶标仪在450 nm处检测吸光度（OD值），并计算抑制率。抑制率（%）=x100%。1.5.2 TUNEL法检测FITC标记的凋亡细胞 培养板中接种细胞悬液（100 μL/孔，1x105/mL），细胞贴壁后加入细胞培养基或消痰散结方保存液，使终浓度为0.47、0.94、1.88 mg/mL，作用72 h后吸除培养液，PBS洗3次。按试剂盒说明，4%多聚甲醛室温固定30 min， 1%Triton X-100通透液室温促渗5 min，PBS洗3次；每孔加入含1000 U的脱氧核糖核酸酶（DNase）反应液室温处理3

7、0 min，PBS洗3次；配制含生物素标志的dUTP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶的工作液，每孔加入50 μL，37 避光反应60 min，PBS洗3次；每孔加入Streptavidin-FITC标记工作液，37 避光反应30 min，PBS洗3次；Hoechst核染液室温避光复染细胞核15 min，PBS洗3次。封片后荧光显微镜观测，激发波长450500 nm，每样品取5个视野，摄图；Image J软件计数阳性细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数细胞总数x100%。1.5.3 Western blot检测Caspase3蛋白表达 细胞裂解后按产品说明用BCA法测定蛋白浓度，等

8、量的蛋白样品（40 μg）经10%SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，鼠抗人β-actin一抗按15000稀释，兔抗人Caspase3一抗按11000稀释，4 孵育过夜；TBST洗膜3次后，加入12000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST再次洗涤3次，加入ECL发光底物，在凝胶成像系统中成像、摄图。重复3次。1.6 统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，对细胞OD值进行曲线拟合，计算IC50；Levene法检验方差齐性，方差齐单因素多水平比较采用Dunnett-

9、t检验，各药物浓度组在不同时点的细胞OD值比较采取重复测量的两因素多水平方差分析；方差不齐，采用多样本非参数Kruskal-Wsllis H检验。P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 消痰散结方对HCT116细胞增殖的影响消痰散结方作用72 h，对HCT116细胞增殖有抑制作用，0.375 mg/mL组细胞OD值与对照组比较差异有统计学意义（P0.05），随着药物浓度增高，抑制作用也增强，0.75、1.5、3.0、6.0 mg/mL组OD值与对照组比较差异有统计学意义（P0.01）；消痰散结方干预HCT116细胞72 h的IC50为0.94 mg/mL（见表1）。0.94 mg/mL

10、和1.88 mg/mL消痰散结方分别作用HCT116细胞24、48、72 h对细胞增殖均有抑制作用，与对照组比较差异有统计学意义（P0.01），与本组24 h比较，作用48、72 h时差异亦有统计学意义（P0.01），随药物浓度增高、作用时间延长，药物对细胞增殖的抑制作用也增强，见表2。结果提示，消痰散结方对HCT116细胞增殖的抑制作用呈现出浓度-时间依赖性。2.2 消痰散结方对HCT116细胞凋亡的影响消痰散结方作用于HCT116细胞72 h，对照组及0.47、0.94、1.88 mg/mL组的凋亡率分别为0.53%±0.18%、2.65%±0.68%、7.81

11、%±0.88%、17.48%±3.85%，各给药组对细胞凋亡均有促进作用，与对照组比较差异有统计学意义（P0.01），随药物浓度升高，凋亡率逐渐增加，促凋亡作用增强。见图1、图2。2.3 消痰散结方对Caspase3蛋白表达的影响消痰散结方作用于HCT116细胞72 h后，Western blot检测Caspase3蛋白表达，并对结果作定量分析，计算各给药组与对照组之间相对表达量。0.47、0.94、1.88 mg/mL组Pro-Caspase3蛋白相对表达量明显降低，与对照组的相对表达量为0.482±0.054、0.581±0.021、

12、0.328±0.036；0.47、0.94、1.88 mg/mL组Cleaved Caspase3蛋白与对照组相对表达量为1.220±0.032、1.035±0.351、2.269±0.277，1.88 mg/mL组Cleaved Caspase3蛋白明显上调。见图3。3 讨论结肠癌属中医癥瘕;肠蕈;锁肛痔;等范畴，丹溪心法有诸病多因痰而生，凡人身上、中、下有块者多是痰;。魏品康教授治疗消化道肿瘤40余年，总结临床经验，认为肠癌多由六淫入侵、饮食不节、忧思过度，导致痰浊内蕴，或夹湿、夹毒，互结积而成肠癌；基于对肠癌病因病机痰本质;的认识，

13、魏品康教授提出消痰散结;的治疗大法，主方消痰散结方，方以法半夏、天南星辛温苦燥，善消痰燥湿共为君，蜈蚣、全蝎等解毒散结通络共为臣，陈皮理气和胃、鸡内金助胃之消导而为佐，炙甘草温中健脾、调和诸药为使，在临床治疗结肠癌疗效显著。为深入研究消痰散结方抗结肠癌机制，本研究用消痰散结方冻干粉溶解液作用于人结直肠癌细胞，观察到消痰散结方对HCT116细胞增殖的抑制作用，并呈浓度-时间依赖性，进一步观察到消痰散结方对HCT116细胞有促凋亡作用，并且凋亡率随作用浓度升高而增加，此种量效关系与消方抑制增殖的趋势是一致的，因此，我们认为促进凋亡是消痰散结方抑制HCT116细胞增殖的机制之一。细胞凋亡又称程序性细

14、胞死亡，细胞凋亡信号调控异常、引起细胞过度积累是导致癌症发生的机制之一【6】。Caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，是在细胞凋亡信号转导中起关键作用的酶蛋白【7】，按功能不同，Caspase家族可分为2类凋亡的启动因子（Caspase2、8、9、10）和效应因子（Caspase3、6、7）。细胞凋亡起始阶段有2条主要途径，均有Caspase家族的广泛参与，功能属启动因子的Caspase参与外源性细胞表面死亡受体途径（Caspase8等）和内源性线粒体途径（Caspase9等），最终殊途同归，都需功能属效应因子的Caspase蛋白激活、执行细胞死亡程序。其中，Caspase3是具有核心地位

15、的效应因子，是细胞凋亡的主要执行者，激活的Caspase3通过降解与细胞结构、细胞信号通路、细胞周期调控、DNA修复等功能相关的蛋白，最终使细胞死亡。正常情况下，Caspase3以无活性的蛋白酶原形式存在，当受到内部或外部的信号刺激后，会酶解为活性酶碎片，即Cleaved Caspase3；因此，Cleaved Caspase3的表达量能反映细胞凋亡水平。活性Caspase3表达量与细胞凋亡率正相关，Caspase3高表达的细胞表现对放化疗敏感性增强，ALK+间变性大细胞淋巴瘤中Caspase3的高表达与良好临床预后相关。本研究亦检测了Pro-Caspase3（无活性形式）和Cleaved C

16、aspase3（活性形式）的表达，发现消痰散结方作用后，各浓度组Pro-Caspase3的表达均下调，1.88 mg/mL组的表达量最低；0.47、0.94 mg/mL组Cleaved Caspase3蛋白上调不明显，1.88 mg/mL组Cleaved Caspase3蛋白明显上调，表明消痰散结方能够增强Caspase3蛋白活性，诱导HCT116细胞凋亡，但0.47、0.94 mg/mL组的表达上调不显著，表明这并非唯一途径，可能还有其他机制参与消痰散结方诱导凋亡的过程，还需进一步研究。综上，本研究表明消痰散结方对人结直肠癌HCT116细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用，其机制可能与Caspas

17、e3活性增强相关，为临床应用消痰散结方抗结肠癌提供了实验依据。参考文献：【1】 赫捷，陈万青.2012中国肿瘤登记年报.北京：军事医学科学出版社，2012：29-31.【2】 李相勇，魏品康.金龙蛇口服液治疗晚期胃癌的疗效观察.湖北中医杂志，2001，23（11）：3-5.【3】 Chih-Jung Yao， Chi-Tai Yeh， Liang-Ming Lee， et al. Elimination of cancer stem-like Side Population; cells in hepatoma cell lines by Chinese herbal mixture Tien

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