总RNA的提取和检测实验报告

1、实验二 总 RNA 的提取和检测 实验目的 1. 掌握从动物组织细胞中提取总 RNA勺方法； 2. 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法； 3. 掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总 RNA勺电泳图谱； 实验原理 （一）概述 1. 10 -5 yg RNA/细胞含有 rRNA 80-85% 28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 2. mRNA 3端存在 20-250 个多聚腺苷酸 （polyA） 结构，可用 oligo（dT） 亲和层 析柱分离mRNA 分离勺方法： 异硫氰酸胍氯化铯超速离心法， 盐酸胍 - 有机溶剂法， 氯化锂 - 尿素

2、 法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 4. 目前常用勺是 Trizol 法。 （二）Trizol 勺主要成分 是一种新型总RNA抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于 解偶剂，是一类强力勺蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞， 使细胞中勺蛋白 / 核酸物质解聚得到释放。 2. 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中 还加入了 8-羟基喹啉、B -巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase 3. 溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相 中。 4. 取出水相用异丙醇沉淀可回收RN

3、A用乙醇沉淀中间层可回收DNA （三）总RNA的纯度检测原理： 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收， 光能量被 吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA在 260nm紫外光波长处有最大 的吸收峰。 因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，0D值为1相当于大约40卩g/mL 的单链RNA用PH=的TE （tris HCI缓冲液）稀释RNA羊品n倍并以TE为空白 对照，根据此时读出的 0D 260 值即可计算出样品稀释前的浓度 : RNA （mg/mL） = 40 x OD 260 读数 X 稀释倍数（n）/1000 实验步骤 （一）羊品处理与 TrizoI 用量

4、 1. 提取组织RNA寸，每50100mg组织（即XX ,约合）用1ml Trizol试剂对组 织进行裂解； 2. 悬浮细胞先离心沉淀，每 5-10 X 106 个细胞加 1mL Trizol 后，反复用枪吹打 或剧烈振荡以裂解细胞。 3. 培养贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol 进行消化、裂解， Trizol 体积按 10cm2/mL比例加入。（注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA勺前提；细胞 数量与 Trizol 的比例，细胞的数量不能过多。 ） （二）操作步骤 1. 细胞中加入 1 mLTrizol 用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置 5min， 使其充分裂解。（注意：

5、此时可放入-70 C长期保持） 2. 按200卩L氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置 2-3min。（注意： 此步一定要振荡混匀，使氯仿和 Trizol 不分层 ） 3. 4 C 12,000g 离心 5-10min 。羊品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相， 上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol 试剂的 60。 4. 吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般 400-450卩L就足够了，千万不要 贪多！（注：千万不要吸取中间界面） 5. 加入与水相等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4C放置5 min。 C 12,000g 离心 10 mi

6、n ，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 8. 加入 1 mL 75%乙醇，（在沉淀对面管壁加入，切勿触及沉淀！ ）盖紧盖子后， 温和转离心管 1 周，充分润洗管壁。 C 12,000g 离心 5 min ，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥5 min。（注：RNA羊品不要过于干燥，否则很难溶解） 11.加入适量冰冷无RNase的PEPC水 （一般10 -20卩L）,充分震荡混匀，瞬时 离心，备用。 （三）检测步骤 1. 将提取的RNA按1： 20加入TE进行稀释 2. 稀释过后用分光光度仪进行检测，先使用 TE行进校对，空白对照，所有样品 要先润洗三次之后，再加入50卩L样液进行检测 3.