实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇

1、生物化学与分子生物学设计实验胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素）小组成员：班级：麻醉 11-2 班日期：2012年 12月 19胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素实验目的1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。2、学习用比色法测定血清尿素。3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。4、进一步熟练UV2100型分光光度计的重点、难点：重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理一、实验原理（一）氧化酶法测定血清总胆固醇血清总胆固醇（TC）包括：游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）两部分。本实验 是胆固醇

2、酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。 第一步：血清胆固 醇 酯可被 胆 固醇酯 酶水解为游 离胆固 醇和游离脂 肪酸 （FFA） 。第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成厶 4-胆甾烯酮和HQ。第三步：HQ在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生 成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC 含量成正比。（二）二乙酰一肟法测定血清尿素 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4， 5- 二甲基 -2- 氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。 因二乙酰不稳定， 故由试剂中二乙酰一肟与强酸作 用产生二乙酰。、操作步骤一）氧化酶法测定血清总胆固醇终点法检

3、测TC,取试管3支按下表依次加样酶法测定TC操作步骤加入物（卩1）空白管标准管测定管血清一一20标准液或定值血清一20一蒸馏水20一一酶试剂1 0001 0001 000混匀后，37C保温10 min,每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于 500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。（二）二乙酰一肟法测定血清尿素取试管3支，按下表依次加样。二乙酰一肟法操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管血清一一0.02尿素标准应用液一0.02一蒸馏水0.02一一二乙酰一肟溶液0.50.50.5酸性试剂5.05.05.0混匀，置沸水浴加热12mi n，取出置冷水中冷却5mi n，以空白管调零，在 5

4、40nm处读取各管吸光度。三、注意事项（一）氧化酶法测定血清总胆固醇1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致；2、比色应在30min内完成；3、试管在操作前尽量保持干燥；4、试剂中酶的质量影响测定结果 ；5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。 （二）二乙酰一肟法测定血清尿素1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度 褪色现象， （ 每小时小于 5%）。煮沸显色经冷却后，应及时比色。2、尿液中尿素也可用此法测定， 但因浓度高，需先用去离子水作 50 倍以上稀释3、注意洁净干燥，加量务必准确。4、水浴时注意打开水浴箱盖，以免水汽入管。5、酸性试剂中酸

5、的含量较浓，要小心使用。四、思考题1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义？2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义？3. 血清非蛋白氮（NPN）与尿素的区别，它包括哪些？小结氧化酶法测定血清总胆固醇， 此方法特异性好和灵敏度高， 既可用于手工操 作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。在终点法中血红 蛋白高于 2g/L 时引起正干扰； 胆红素高于 0.1g/L 时有明显负干扰； 血中维生素 C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。但是在速率法中上述干扰物 质影响较小。高TG血症对本法无明显影响。检测TC的血清（浆）标本密闭保存时， 在4C可稳定1周，20C可稳定半年以上。二乙酰一肟法测定血清尿素， 试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。 在标本数量多时加热开始难以达到 100C，各管间受热温度也可能不一致，因而 本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm勺网垫,在网垫上加热显色，可使 CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。线性上限仅达 7.14mmol/L ;回收率为96%-102.1%。二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在 的含氮化合物。 很多其它化合物在结构中会有尿素的残基， 如瓜氨酸、四氧嘧啶 和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血