感受态细胞制备

1、受态细胞制备实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。实验原理在基因克隆技术中， 所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞， 表达 相应的选择标记基因， 并在一定的培养条件下， 在选择性培养基上长出转 化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达， 从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源 DNA 的能力最高时的状态被称 为感受态细胞。 有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态， 而另 一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态 ,如大肠杆菌。大肠 杆菌的感受态细胞制备原理是

2、取对数生长期的细菌处于 0， CaCl2的低 渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase的羟 基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞 吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂 增值， 被转化的细菌中， 重组子中基因得到表达。 对这种现象的一种解释 是 CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通 过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源 DNA 进入胞内，从而实 现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出 1到 2个数量级，达到 1x108转化子每 1gDNA，甚至 1x109 转化

3、子每 1gDNA，所以常用于文 库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以 在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转化。物理制备法： 电转法， 除化学法转化细菌外， 还有电击转化法， 电击法不需要预先诱导 细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使 DNA 进入细菌，转化率最高能达 到 1091010转化子/ g 闭环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子， 根据此皿中的菌落数 可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体 积转化率(转化子数每 g 质粒 DN

4、A)转化子总数质粒 DNA加入 量(g)理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为 1*1010三、实验材料 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、 移液枪、锥形瓶、 离心管、 LB液体培养基、实验试剂： 0.1MCaC2l溶液、含 10%甘油的 0.1MCaC2l 溶液、GYT、三蒸水、 10%甘油的水溶液、 DH5、 Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。 实验步骤（一）化学感受态细胞的制备（1）菌种的活化： 取-70的冰箱中感受态细胞 DH5、Top10、DE3、BL21 在 LB 的平板上进行划线分离。（ 2）菌种的前培养：从 LB 平板上挑取相应的单菌落 ,接种

5、于 10mlLB 液体 培养基中， 37振荡培养过夜至对数生长中后期。（3）菌种的准备：将该四种菌悬液以 1:100 的比例分别接种于四个不含 有抗生 100mlLB液体培养基锥形瓶中 ,37振荡培养大约 2.5 小时至 OD=0.40.5。（4）感受态细胞的制备： 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100mL 培养液均匀分成两 份到 50mL离心管中，在 4、 3000 转每分钟，离心 10min。 弃去上清液，加入 30mL0.1M的 CaC2l溶液，轻轻混匀，在冰水中静置 30min。 弃去上清液，加入 30mL0.1M的 CaC2l溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀 充分混匀，在冰水中

6、静置 30min。 从冰水中取出 4、3000 转每分钟，离心 10min，弃去上清液并用移液 枪轻轻地把多余的液体吸干净， 加入 0.5mL含 10%甘油的 0.1MCaC2l 溶液。 用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。 把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好 0.5ml 离心管，用 剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装 40L悬浮液。 迅速盖好盖子放入到液氮中， 使之迅速冷冻， 然后放到标有感受态细胞 种类、制作者和时间的袋中， -70保存。（二）电转化的感受态细胞的制备第 1、 2、3 步同化学转化的感受态细胞的制备过程的 1、2、3 三步相同。 （4）制备

7、感受态细：把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100mL 培养液均匀分成两 份到 50mL离心管中，在 4、 3000 转每分钟，离心 10min。 弃去上清液，加入 30mL 三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使 沉淀充分混匀，在 4、3000 转每分钟下离心 10min，倒去上清。重复两 次；再加入 30mL含 10%甘油水溶液，在 4、3000 转每分钟下离心 10min， 重复一次。弃去上清液，加入 0.5mLGYTmedium（含有 10%Glysiron、0.125%YeastExtraction、 0.25%Trypton），放置在冰上。（5）准备好成有液氮的塑料盒子和把

8、 0.5mL 离心管若干放到离心管架子 上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管 40 l，迅速盖好盖子放 入到液氮中， 使之迅速冷冻， 然后放在标有感受态细胞种类、 制作者和时 间的袋中， -70保存。（三）效价检测1、化学转化：（ 1）取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒 PUC19稀释十 倍置于冰上。（2）在含有 40l 感受态细胞的 0.5ml 离心管中加入 1L 稀释后的标准 质粒充分混匀。冰上静置 30min。（ 3）将离心管置于 42干式恒温器上 90s，然后迅速放回冰上，使细胞 冷却 23min 。（4）向离心管中加入已预热的无菌 LB培养液 400L，再转移到 1

9、0ml 离 心管中， 37恒温振荡培养 4560min。（5）将离心管内容物混匀，分别吸取 4.4L 和 110L 菌液于含有 AMP 的 LB 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板 置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在 37过夜培养，然后通过菌 落数计算效价。2、电转化 :（ 1）取电转化感受态细胞于冰上解冻， ,标准质粒也置于冰上，同时准备 干净的电击杯于冰上预冷。（2）在含有 40l 感受态细胞的 0.5ml 离心管中加入 1 L稀释十倍的标 准质粒，充分混匀。 然后转移到电击杯中， 把电击杯放在电击仪上进行电 击（ 2500V，5ms）。（3）在电击杯中加入 1

10、60L 无菌 LB培养液（无抗生素），然后充分混 匀，吸取于 10ml 离心管中，置于 37恒温振荡器中培养 45 60min.（4）分别取 2L和 50L涂板，涂板操作同化学转化。（ 5）平板放到 37的恒温培养箱过夜培养。第二天早上读取两个平板的 菌落数。四、实验结果1、电转化感受态细胞的效价：涂 2 L菌液的平板上菌落数为 88 个，通 过计算知道，电转化感受态细胞的效价为 8.8108。 2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出来结果。五、讨论1、感受态细胞制备及转化中的影响因素细胞生长状态和密度 :不要用经过多次转接或储于的培养菌， 最好从 70或-20甘油保存的菌种

11、中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长 密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。密度过 高或不足均会影响转化效率。 质粒的质量和浓度 :用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA。转化效 率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比 ,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积 过大时 ,转化效率就会降低。 1ng的标准质粒即可使 50l 的感受态细胞达到饱和。 一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5。 试剂的质量 :所用的试剂 ,如 CaC2l 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制， 最好分装保存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行 ,所用器 皿,如离心管 ,枪头等最好是新的 ,并经高压灭菌处理 ,所有的试剂都要灭菌 ,且注意 防止被其它试剂、 DNA酶或杂 DNA所污染 ,否则均会影响转化效率或杂 DNA的转 入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。2、效价检测结果分析：