培养基配制及适用性检查标准操作规程

1、欢迎阅读目的：文件名称培养基配制及适用性检查标准操作规程文件编号SMP-10-QC-009版本号00起草部门质量控制部审核部门批准人起草人审核人批准日期起草日期审核日期生效日期颁发部门质量控制部分发号分发部门质量保证部质量控制部建立培养基配制及适用性检查的标准操作 规程，规范实验人员的操作流程范围：适用于微生物检验人员对培养基的规范管理。依据：药品生产质量管理规范（ 2010 年修订）、中华人民共和国药典 2015 年版 第四部 职责：1. 微生物检验员：负责实验室所需求的培养基管理工作，使日常检验可以顺利进行。2. 微生物检验主管：负责对日常配制培养基的规范操作进行监督。内容1 培养基的申购

2、根据检验项目、工作量和工作进度的需求，提前一个月进行所需的培养基申购。申购时需指定培养基供应商，必要时进行供应商审计。2 培养基的验收欢迎阅读2.1 培养基到货后， 微生物室检验员应进行验收。 验收内容包括核对品名、 数量、规格、生产厂商， 应与申购单一致；检查培养基包装有无破损、包装是否完整、产品是否在有效期内。2.2 验收合格后，登记于培养基领用台账 （附记录文件编号： SMP-10-QC-009-02 （00 ）。3 培养基的贮藏3.1 未开封的脱水培养基贮存于阴凉室，使培养基处于低温、干燥、和避光条件下。已开封的脱水 培养基应盖紧，贮存于阴凉库。3.2 灭菌好的培养基应进行预培养 72

3、h检查无菌后，置 48冷藏保存待用。 灭菌后培养基储存期 为 7 天。4 培养基 的配制4.1 培养基的配制和使用应填写 培养基配制及使用记录（附记录文件编号：SMP-10-QC-009-02 （00 ）。4.2 培养基配制批号原则：原材料批号 -配制日期：比如 2011年 1月1日配制的培养基，培养基干 粉批号 000000，配制批号为 :000000-110101 。配制好的培养基贴培养基标签（附记录文件编 号：R-SMP-10-QC-009-03）。（注：同一天同一培养基配置多次的，在原批号后加“ - ”加“数字” 表示，如 000000-110101-01 ）4.3 培养基配制方法.1

4、使用商品化脱水合成培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如重量/ 体积、 pH、灭菌条件和操作步骤等。实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息如：培养 基名称和类型及试剂级别，每个成分物质含量、制造商、批号，pH值，培养基体积 / 分装体积，灭菌条件（灭菌方式、温度及时间），配制日期、人员等，以便溯源。4.3.2 水、容器具要求：培养基配制均采用纯化水，特殊说明时采用去离子水和蒸馏水。培养基配制所用容器和配套器具应洁净。 对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器应先进行预灭菌， 以 保证培养基的无菌性。4.3.3 称量与分装：快速称量所需量的脱水合成培养基（

5、必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防 吸入含有有毒物质的培养基粉末） 。以免吸潮。先加入适量的水， 充分混合。注意避免培养基结块，欢迎阅读然后加水至所需的量。根据说明书要求选择是否加热。分装体积不超过容器体积的2/3 。配制斜面等含琼脂的培养基也需加热煮沸至完全溶解后分装。4.4pH值的测定和调整pH值采用 pH计进行检测，温度 252。取配后培养基 10ml进行灭前 pH测定。另取 20ml于 50ml 三角瓶与同批配制培养基同时灭菌冷却至 25 2检测灭后 PH。灭菌前后 pH应按下表进行控制。 灭菌前可使用浓度约为 40g/L（约 1mol/L ）的氢氧化钠溶液或浓度约为 36.5g/L

6、 （约 1mol/L ）的盐 酸溶液进行缓慢调整， 避免反复调整而增加离子浓度。 灭菌后培养基不符合标准时视为不合格， 不 进行使用。4.5 培养基灭菌培养基和试剂应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。 湿热灭菌在高压灭菌锅或蒸汽灭菌柜中进行， 容 器具若需湿热灭菌时， 灭菌条件为 121灭菌 30min。培养基严格按说明书条件进行灭菌。 培养基灭 菌后应立即取出，不得存放于高压灭菌器中。5 培养基 的质量控制1计数培养基适用性检查5.1.1 菌种及菌液制备菌种：试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用 适宜的菌种保藏技术进行保存， 以保证试验菌株的生物

7、学特性。 计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验用菌株见表 1。菌液制备： 按表 1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的 新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中， 35 培养 18 24 小时，取上述培养物 1ml 加入 9ml0.9 无菌氯化钠溶液中，制成 10-1 的菌液，依法 10 倍稀释至 10 -7 ，分取各菌悬液 1ml 注入 平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml ，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数， 取小于 100CFU/ml 的菌液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25 培养 23 天。取上述培养物 1

8、ml 加入 9ml0.9 无菌氯化钠溶液中，制成 10-1 的菌液，依法 10 倍稀释至 10 -7，取菌悬液 1ml 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基 25ml ，各菌悬液平 行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于 100CFU/ml 的菌液备用；取黑曲霉的新鲜培养物接欢迎阅读种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经 25 培养 57 天，加入 3 5ml 含 0.05% （ml/ml ）聚山 梨酯 80 的 0.9 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，取上述培养物 1ml 加入 9ml0.9 无菌氯化钠溶液中，制成 10-1 的菌液，依法 10 倍稀释至 10 -7

9、，分取各菌悬液 1ml 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基 20ml ，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培 养计数，取小于 100CFU/ml 的菌液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2?8，可在 24 小时内使用。黑曲霉 孢子悬液可保存在 2?8, 在验证过的贮存期内使用。5.1.2 阴性对照为确认试验条件是否符合要求， 应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无菌生长。 如阴性对照有菌 生长，应进行偏差调查。5.1.3 培养基适用性检査 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 按表 1 规定，接种不大于 l00c

10、fu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板 或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表 1 规定条件下培养。每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.5?2 范围内，且菌 落形态大小应与对照培养基上的菌落一致； 被检液体培养基管与对照培养基管比较， 试验菌应生长 良好。表1试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌 (Staphylococc

11、u saureus) CMCC(B)26003胰酪大豆胨琼脂培 养基或胰酪大豆胨 液体培养基培养温 度30?35，培养时 间18?24小时胰酪大豆胨琼脂培养 基和胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30?35 , 培养时间不 超过 3天，接种量不大 100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基 或胰酪大豆胨液体培养 基（ MPN法），培养温度 30?35 , 培养时间不超 过3天，接种量不大于 l00cfu欢迎阅读铜绿假单胞菌 (Pseudomonasae ruginosa) CMCC(B)10104 胰酪大豆胨琼脂培 养基或胰酪大豆胨 液体培养基，培养 温度 30?35 ，培养 时间 18?24 小时胰酪

12、大豆胨琼脂培养 基和胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30?35，培养时间不 超过 3天，接种量不大 于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基 或胰酪大豆胨液体培养 基（ MPN法），培养温度 30?35，培养时间不超 过3天，接种量不大于 l00cfu枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis) CMCC(B)63501胰酪大豆胨琼脂培 养基或胰酪大豆胨 液体培养基，培养 温度 30?35 ，培养 时间 18-24 小时胰酪大豆胨琼脂培养 基和胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30-35 ，培养时间不 超过 3天，接种量不大 于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基 或胰酪大豆胨液体培养 基（ MPN

13、法），培养温度 30?35，培养时间不超 过3天，接种量不大 l00cfu白色念珠菌(Candidaalbica ns) CMCC(F)98001沙氏葡萄糖琼脂培 养基或沙氏葡萄糖 液体培养基，培养 温度 20?25，培养 时间 2?3天胰酪大豆胨琼脂培养 基，培养温度 30?35，培养时间不 超过 5天，接种量不大 于l00cfu沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度20?25，培养 时间不超过 5天， 接种量不大于 l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基 （MPN法不适用），培养 温度 30?35，培养时间 不超过 5天，接种量不大 于 100cfu沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度 2.0?25

14、，培 养时间不超过 5 天，接种量不大 于l00cfu黑曲霉( Aspergillusn iger ) CMCC(F)98003 沙氏葡萄糖琼脂培 养基或马铃薯葡萄 糖琼脂培养基，培 养温度 20?25，培 养时间 5?7天，或直 到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养 基，培养温度 30?35，培养时间不 超过 5天，接种量不大 于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度20?25，培养 时间不超过 5天， 接种量不大于 l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基 （MPN法不适用），培养 温度 30?35，培养时间 不超过 5天，接种量不大 于 l00cfu沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度20?

15、25，培养 时间不超过 5天， 接种量不大于 l00cfu5.2 控制菌检查用培养基适用性检查5.2.1 菌种及菌液制备菌种：试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用 适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。菌液制备：按表 1 规定程序培养各试验菌株。取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙 型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中， 35培养 1824 小时，取上述培养物 1ml 加入 9ml0.9 无菌氯化钠溶液中，制成 10 -1 的菌液，依法 10 倍稀释至 10 -7 ，分取各菌悬液 1ml 注入平皿中，

16、立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml ，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于 100CFU/ml 的菌液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体 培养基中， 25培养 23 天。取上述培养物 1ml 加入 9ml0.9 无菌氯化钠溶液中，制成 10-1 的菌液，依法 10 倍稀释至 10 -7，取菌悬液 1ml 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基 20ml ，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于 100CFU/ml 的菌液备用；欢迎阅读菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2?8，可在 24 小时内使用。2.1.3 阴性对照为确认试验条

17、件是否符合要求， 应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无菌生长。 如阴性对照有菌 生长，应进行偏差调查。2.2 培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、 由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检 查。控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、 抑制能力及指示特性的检查。 各培养 基的检查项目及所用的菌株见表 1。表1控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力 +指示特性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌

18、麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力 +指示特性大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌沙门菌RV沙门菌增菌液体培养 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力 +指示特性指示能力乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基促生长能力促生长能力 +指示特性 促生长能力 +指示能力 抑制能力白色念珠菌 白色念珠菌 白色念珠菌 大肠埃希菌2.2.1 液体培养基促生长能力检査分别接种不大于 100cfu 的试验菌 （表1）于被检培养基和对照培养 基中，在

19、相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养， 与对照培养基管比 较，被检培养基管试验菌应生长良好。2.2.2 固体培养基促生能力检査用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌（表 1） 于被检培养基和 对照培养基平板上， 在相应控制菌检査规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养， 被检 培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致2.2.3 培养基抑制能力检査接种不少于 l00cfu 的试验菌（表 1） 于被检培养基和对照培养基中，在欢迎阅读相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。2.2.4 培养基指示特性检査用涂布法分

20、别接种不大于 100cfu 的试验菌（表 1） 于被检培养基和对照 培养基平板上， 在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养， 被检培养 基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。6 培养基销毁 失效、检测用过培养基（无论是否有菌生长）均按废物进行高压蒸汽灭菌处理。参照实验室 废弃物管理规程（文件编号： SMP-10-QC-014 （00 ）。相关文件：文件名称文件编号检定菌管理规程SMP-10-QC-010实验室废弃物管理规程SMP-10-QC-014 （00 ）相关记录：记录名称记录编号培养基登记台账R-SMP-10-QC-009-01培

21、养基配制及使用记录R-SMP-10-QC-009-02培养基配制标签R-SMP-10-QC-009-03计数培养基适用性检查报告R-SMP-10-QC-009-04计数培养基适用性数据记录R-SMP-10-QC-009-05控制菌培养基适用性测试记录R-SMP-10-QC-009-06控制菌培养基适用性检查报告R-SMP-10-QC-009-07文件变更历史：文件修订及变更原因生效日期文件编号版本号新修订。SMP-10-QC-00900培养基领用台账R-SMP-10-QC-009-01(00)培养基名称供应商进厂编号规格安全库存量日期批号入库量领用数量剩余库存领用人管理人备注年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日年月日培养基配制及使用记录R-SMP-10