小鼠染色体的制备观察染色

1、体的制备观察GE GROUP system office room GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-Life Science College细胞生物学实验报告姓名：柳伟雄学号：201300140062班级：2013级生科一班同组者：曾玮皤山东大学实验报告 2015年6月1日姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮墙科目：细胞生物学实验 题目：小鼠染色体的制备、染色、观察一、目的和要求1. 初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。2. 了解常用实验动物染色体的数目及特点。3. 认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组

2、形图。二、原理凡处于活跃増殖状态的细胞，或者经过各种处理后，任何动物组织的细胞就可进入分裂， 均可用于染色体分析。在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射 定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法 制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养 和无菌操作，易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方 面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：1.用一定剂量的秋水仙 素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期，使中期染色

3、体停留在赤道面处；2.用低 渗法使细胞膨胀，以至于在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上；3.空 气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平，经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图 象。Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。主要用 Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰 的细胞及染色体图像。三、试剂和器材1试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的立C1溶液）、0.3WKC1低渗溶液、固定液（甲醇:冰醋酸二3 : 1）、Giemsa染液Giemsa染液的配制:吉姆萨粉（Giemsa stain）甘油（AR）甲醇（AR

4、）将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再分批加入甘油，放56/温箱中2h后，分批加入甲醇，将 配制好的染液密封保存棕色瓶内（最好于04C。保存）。使用前，将母 液用PBS稀释后使用。2. 器具：解剖盘、鰻子、眼科剪、小烧杯（x2）、吸管、玻璃刻度离心管、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等3. 材料：小白鼠四、实验步骤 制片1取雄性小鼠以每克体重4歩注射秋水仙素，经14 - 16小时后，断头法杀死小鼠，取出 睾丸用生理盐水（0.9%的N&C1溶液）洗去血污。2. 将睾丸放入装有lml 0. 3%KC1低渗溶液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。3. 用铜

5、网过滤到玻璃刻度离心管中，再加0. 3%KC1缓冲溶液至4mlo4. 静置30min,进行低渗处理。5. 以 800 1000r/min 的转速离心 8mino6. 取出离心管，弃去上清液，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1）,并用吸管 至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8mino7再以 800 1000r/min 转速离心 8mino8. 弃上清，加入lml固定液，再制成细胞悬液，固定5mino9. 取洁净的低温预冷载片，距载片10-15cm高度滴下23滴细胞悬液，从载片一边向另边轻轻吹气，同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。10. 用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成

6、文火干燥。染色11. 用Giemsa染色20 30min,细水冲洗玻片背面，去多余染液,气干。本实验染色采用倒置染色法，具体方法如下：在玻璃板上用废旧载玻片作支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，在 玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快 速挥发，三可以防止染液颗粒沉淀，影响观察.在操作时应注意，多个样品同时染色 应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着 色12. 镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态 并计数。五、实验结果本金验采用的是小鼠的精巢，部分细胞处于减数第一次分裂中

7、期，这样的细胞是二倍体， 应有40条染色体；有些处于减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色 体。还有一些细胞处于分裂期，但不是中期，这类细胞染色体的凝集程度不是很高。经过仔细查找，最终找到处于减数分裂中期的染色体。如图，处于减数分裂中期的染色体 染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体（17、18对染色体为亚端 部）.呈“V”字形或炉字形。由于重叠较多，数目难以数清。六、注意事项1. 断头法处死小鼠后，血液要冲洗干净，以免影响之后的实验的进行。2. 从开始加入0. 3%KC1低渗溶液至37C。恒温水浴低渗处理结束，时间控制在oOmin以 内。3两次离心的转速控制在800 - 1000转/分，不要太高，以免破碎细胞。4滴片时，使滴管与载玻片间的距离尽量远，这样细胞才能被“摔碎，使眼睛、滴管、载 玻片竖直成一条直线，保证细胞悬液能被滴在载玻片上。5滴完片之后，将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打，使未破碎的细胞破碎。6