三聚氰胺的性质及检测方法DOC

1、三聚氰胺的性质及检测方法2011级食工一班 郭佳1701120110111三聚氰胺的理化性质三聚氰胺（英文：Melamine ）分子式为C3H6N6,分子量为126. 12,俗称密胺、 蛋白精，IUPAC命名为“ 1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机 化合物，为白色单斜晶体，无毒、无味，不可燃烧，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油 及吡啶等，微溶于水、乙醇，不溶于苯、乙醚、四氯化碳。相对密度为1.573g/cm3, 熔点为354 C高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性的烟 雾。三聚氰胺呈弱碱性，在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成各种羟甲基三 聚氰胺,但在微

2、酸性（pH值5. 56. 5）环境下，可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反 应而生成树脂产物。另外，三聚氰胺三种同系物：三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三 聚氰酸二酰胺。三聚氰胺是一种用途十分广泛的有机化工原料，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺部分物理性质：熔点（C）: 300 （升华）相对密度（水=1）： 1.573 相对蒸气密度（空气=1）: 4.34饱和蒸气压（kPa）: 6.66水中溶解度（20C）： 0.33g2三聚氰胺的毒性动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部出现结石, 并可进一步诱发膀胱癌对于肾脏，短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰，长期接触还会造

3、成肾脏组织损伤。三聚氰胺同系物具有三聚氰胺一样的毒性效 应,很多研究都将它们作为三聚氰胺复合物（MCs）进行总体毒理学评价。3第一法高效液相色谱法（HPLC3.1原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效 液相色谱测定，外标法定量。3.2试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。甲醇乙腈氨水三氯乙酸柠檬酸辛烷磺酸钠甲醇水溶液三氯乙酸溶液（1%）氨化甲醇溶液（5%）离子对试剂缓冲液三聚氰胺标准品三聚氰胺标准储备液阳离子交换固相萃取柱定性滤纸海砂微孔滤膜氮气3.3仪器和设备高效液相色谱（HPLC仪分析天平离心机超声波水浴固相萃取装置

4、氮气吹干仪涡旋混合器具塞塑料离心管研钵3.4样品处理3.4.1提取341.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等称取2 g （精确至0.01 g ）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL 三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低 于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯 乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。341.2 奶酪、奶油和巧克力等称取2 g （精确至0.01 g ）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的 4 倍6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑

5、料离心管中，用15 mL三氯乙酸 溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入 5 mL乙腈，余 下操作同3.4.1.1中“超声提取10 min，加入5 mL水混匀后做待净化液”。注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。3.4.2净化将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3 mL水和3 mL甲醇洗 涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1 mL/min。洗脱液于50C下用氮气吹干，残留物（相当于 0.4 g样品）用1 mL流 动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

6、3.5高效液相色谱测定3.5.1标准曲线的绘制用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80卩g/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积 -浓度作图，得到 标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图参见附录A中的图A1.A.i 如朋lW. hplc3.5.2定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。3.5.3结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：A X c X V X 1000 X= X f （1）AsX mX 1000 式中：X试样中三聚氰胺的含量，单位为毫

7、克每千克（mg/kg）；A 样液中三聚氰胺的峰面积；c标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（卩g/mL）V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）;As 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；m试样的质量，单位为克（g）;稀释倍数3.6空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.7方法定量限 本方法的定量限为2 mg/kg。3.8回收率在添加浓度2 mg/kg10 mg/kg浓度范围内，回收率在 80%-110%之间，相 对标准偏差小于10%3.9允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%4第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS4.1原理试

8、样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。4.2试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。乙酸。乙酸铵。乙酸铵溶液（10 mmol/L ）:准确称取0.772 g 乙酸铵于1 L容量瓶中， 用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。其他同3.2。4.3仪器和设备液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 其他同3.3。4.4样品处理4.4.1提取奶粉称取1 g （精确至0.01 g ）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL三 氯乙酸溶液和2 mL乙腈，超声提取10 min

9、，再振荡提取10 min后，以不低于 4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化 液。4.4.2净化将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3 mL水和3 mL甲醇洗 涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1 mL/min。洗脱液于50C下用氮气吹干，残留物（相当于 1 g试样）用1 mL流动 相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。4.5液相色谱-质谱/质谱测定4.5.1标准曲线的绘制取空白样品按照4.4处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级 稀释得到的浓度为0.01、0

10、.05、0.1、0.2、0.5卩g/mL的标准工作液，浓度由 低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基 质匹配加标三聚氰胺的样品LC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录 A中的 图 A.2。阳A.2肛麻三聲亂胺的柑朋LC-MSA1S艺反威證测用质邑氓阳 （隊厨时2 rnim 誌性禺子m临127：-5和mAr 127XB）4.5.2定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.5.3定性判定按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间 与标准工作溶液一致（变化范围在土2.5%之内）；样品中目

11、标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。表1定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%! 50%10%i 20%!71 和 m/z 342327)5.5.2定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释，重新衍生化后再进样分析。5.5.3定性判定5.5.3.1 GC-MS 法以标准样品的保留时间和监测离子（m/z 99、171、327和342 ）定性，待 测样品中4个离子（m/z 99、171、327和342 ）的丰度比与标准品的相同离子 丰度比相差不大于20%

12、。5.5.3.2 GC-MS/MS 法以标准样品的保留时间以及多反应监测离子（m/z 342327、342171）定性,其他定性判定原则同4.5.5。5.5.4结果计算同3.5.4。5.6空白实验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。5.7方法定量限本方法中，气相色谱-质谱法（GC-MSfc）的定量限为0.05 mg/kg，气相色 谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法）的定量限为0.005 mg/kg。5.8回收率GC-MS 法：在添加浓度 0.05 mg/kg2 mg/kg浓度范围内，回收率在 70% 110沱间，相对标准偏差小于10%GC-MS/MS法:在添加浓度0.005 mg/k

13、g1 mg/kg浓度范围内，回收率在90% 105沱间，相对标准偏差小于10%5.9允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值 的15%6表面活性剂增敏荷移反应紫外分光光度法测定三聚氰胺6.1原理CTMAB寸三聚氰胺与四氯对苯醌(TCBQ)荷移反应产物具有显著的紫外光 谱增敏作用，反应产物的吸光度值与三聚氰胺的浓度之间具有良好的线性关系。 据此建立了一种三聚氰胺的紫外光谱测定新方法。三聚氰胺分子中-NH2上的氮原子有一对孤对电子，空间阻碍又小，是良好的 电子供体，而TCBQ是一个很强的平面型 n电子受体，因此，在乙腈溶液中 MEL与TCBQ形成了 n- n型荷移配合

14、物。用摩尔比法测得配合物的组成为1 : 3,表明是一个三聚氰胺分子中通过三个-NH2上的氮原子与三个TCBQ分子进行 荷移反应，形成了 n- n型荷移配合物(TCBQ)3MEL结构稳定，新出现的309nm 吸收峰正是该荷移反应产物的特征吸收峰。其形成原理可表示如下：CIci収也r当向该体系加入 CTMAB 后，MEL + TCBQ +CTMAB 溶液的特征吸收峰位不变，但 峰高明显增强，反映出表面活性剂 CTMAB 对MEL与TCBQ的荷移反应具有增敏效应 6.2仪器与试剂UV-2550型紫外分光光度计；PB-21型精密酸度计。奶粉；三聚氰胺(sigma 试剂，99%)溶液四氯对苯醌(TCBQ

15、)乙醇溶液(1.0 x 10-3mol / L);十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液(0.2g/L);Tris-HCl 缓冲溶液 pH = 7.55;Twee n-20;十二烷基苯磺酸钠(SDBS);十二烷基硫酸钠(SDS);乙腈。三聚氰胺分子印迹聚合物固相萃取柱：自制。 所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。6.3实验方法三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的制备：以三聚氰胺为模板分子，以a -甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯 酸酯为交联剂，以乙醇-水(5:1，V/V)为溶剂，60C聚合24 h,制备三聚氰胺 分子印迹聚合物。取适量聚合物粉末装入固相萃取空柱中，两端分别用滤膜垫片堵住，备

16、用。奶粉样品的制备：参照国标法处理样品：在离心管中分别准确移取1 mL或1. 0g牛奶样品， 加入5 mL1%三氯乙酸(pH = 3. 0 )和乙腈混合液(3: 1，V/V)，超声10 min，振荡10 min，以8000r / min 离心10 min，转移合并上清液，将上 清液减压蒸干，水溶，用0. 45卩m微孔滤膜过滤得样液。吸光度的测定：于10 mL比色管中，依次加入一定量 MEL工作液、TCBQ溶液1.8 mL、 CTMAB容液0.5 mL和Tris-HCI 缓冲溶液1.2mL;再取一 10ml比色管，依次 加入一定量的奶粉样品、 TCBQ溶液 1.8 mL、CTMAB溶液 0.5

17、mL 和 Tris-HCl 缓冲溶液1.2mL。所有比色管摇匀，用乙腈定容至5ml，于30C水浴中反应40min 后，取出冷却至室温，用1cm吸收池，以试剂空白为参比，在 309nm处测其吸 光度。6.4数据处理用所得的吸光度值做线性回归方程，求出样品中的三聚氰胺含量。6.5共存物质的干扰当三聚氰胺溶液浓度为1.0 X10_ 6moI/L，测定的相对误差在土 5%范围内时 发现，牛奶中一些常见物质对三聚氰胺测定的最大允许倍数分别是:Mg2+( 200)K+(200)、Fe3+(100)、Cai +(50)、Zn2+(10)、蔗糖(50)、葡萄糖(200)、 麦芽糖(200)、维生素C(100)

18、。2.2.6样品加标回收率采用两种方法测定样液，均未检出三聚氰胺。对样品进行三个浓度水平的加 标回收率测定，结果见表2.1。可见新建分光光度法测定三聚氰胺结果满意；用 两种方法进行样品预处理时，方法 2的加标回收率优于方法1，反映自制固相 萃取柱预处理样品效果更好。表2.1方法1编号加入量c / ( 卩 mol / L)测量值c / ( 卩 mol / L)回收率/ %RSD / %10.40.474118.51.920.80.70588.12.131.61.41688.51.5方法2编号加入量测量值回收率RSDc / ( 卩 mol / L)c / ( 卩 mol / L)/ %/ %10.

19、40.413103.21.320.80.78898.50.731.61.57998.71.17表面解吸常压化学电离质谱法7.1实验原理由于三聚氰胺呈碱性，在正离子模式下易质子化形成M+H+的分子离子，因 而在质谱中获得很强的信号峰（m /z127）。选择m /z127分子离子峰进行二级质 谱研究,主要得到特征离子m /z110,85,68和60（如图2所示），分别为母离子丢 失NH、NHCN NHCN及NH、HNCNC所致,另外，二级质谱碎片离子 m /z85的三 级质谱中，可产生m /z68的碎片离子，为二聚氰胺质子化离子进一步丢失NH所致。为了确保结果的可靠性,实验还采用ESI-MS方法对

20、三聚氰胺进行了 MS/MS 谱对照分析,并且通过氘代三聚氰胺的SDAPCI-MS/M谱图对有关特征离子的结 构式（如图2及图3所示）进行了确认。如果在实际样品中能够检测到信号峰m/z127,并且在MS/MS谱中观察到主要特征离子 m /z110、85（基峰）、68和60,则 可以判断该样品中含有三聚氰胺，如图3所示。FriJunpunq00510 -a. o o o 6 4 2V t屮 T- 上-So o D o o8 6 4 2盂齢&xiflPIHzc rIL kL 削人/ M 丿収/w70r- - r-50O* P r 4 So 0 o Q 8 w 4 2 一o o o o o0 8 6

21、4 21*(ol406080200002040N HP6n3JnV用002图2二聚滅槪的SDAPC1质谱图，插图为用Z： 127 09 - 级质诺图閤3奶粉样iffi的SDAHJ质诰團插图为m/z 127 tfj一一级质谱图7.2仪器与试剂SDAPC离子源：如图1所示。LTQ-XL型线性离子阱质谱仪。三聚氰胺,使用 时配置成100. 0 mg/kg水溶液备用；奶粉样品。(t i f IIV7.3实验方法线性回归方程建立：配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100uL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-M实验。 7

22、.4数据处理将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m/z85的净响应信号强度表示，每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差。信 号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01100 mg/kg范围内,离子 强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。对0. 10 mg/kg标准样品 进行测定，获得净响应信号强度为72(n=6)。本方法三聚氰胺的检出限为8.8Lg/kg。7.5线性范围、检出限、回收率和精密度配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取 100LL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中，按前述实验方

23、法进行SDAPCI-MS实验。 将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m/z85的净响应信号强度表示，每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差(括号内)依次为：58(9.2% )、72(3.9% )、98(5.6% )、145(8.3% )、205(5.8% )。信号 强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01100 mg/kg范围内,离子强 度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。线性回归方程 Y=0.1402X+2.0168,相关系数 r=0. 990。对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6),并测得 空白

24、样品的3倍标准偏差为6. 336(S/N=3, n=20),计算得本方法对三聚氰胺的 检出限为8. 8Lg/kg。回收实验时,在9份0. 1 g奶粉样品中,3份加入100LL水,6份分别加入 100LL 1.0 mg/kg 和5.0 mg/kg(各3份)三聚氰胺的标准溶液,按照实验方法进 行测定。获得样品中三聚氰胺含量为 2. 2 mg/kg(n=6),加标回收率分别为：93. 1% 105. 4%、112. 8%、97. 5%、86. 7%、10312% 这可能是由于手动进样时的 不稳定性(如抖动等原因)和样品表面不均匀性造成的，如果采用自动进样则可能 克服此问题，进一步提高其分析性能。8超

25、高效液相色谱-串联质谱法8.1原理三聚氰胺是一种弱碱性化合物，微溶于冷水，可溶于甲醇、乙腈、甲醛、乙酸、 三氯乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本实验以含5汇酸铅的三氯乙酸的溶液做为提取液，能够有效沉淀样品基质中的蛋白。样品经过甲基叔丁基醚的液液萃 取，能有效地除去基质中的油脂。采用混合阳离子交换固相萃取柱能进一步除去 样品基质干扰，提高方法的回收率及灵敏度。8.2实验仪器与试剂Agilent1200超高效液相色谱仪离心机涡旋混合器固相萃取仪氮吹仪乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级),乙酸铵(HPLC级),超纯水,三聚氰胺标准品 (纯度99%)，三氯乙酸(分析纯),乙酸铅(分析纯),氨水(分析纯

26、),水(超纯水), PCX混合阳离子交换柱(60 mg/3 mL)。三聚氰胺标准储备液(1 mg/mL),三聚氰胺标准工作液（5Lg/mL）。三聚氰胺标准溶液（11000 ng/mL）。8.3实验步骤样品提取：准确称取2.0 0.01 g待测样品于50 mL离心管中,加入20 mL提取液（含 5%乙酸铅的三氯乙酸溶液），液体样品加提取液定容至20mL,涡旋2 min,超声提取 25 min,静置 2 min,10000 rPmin 离心 10 min。样品净化：将离心液倒入装有20 mL甲基叔丁基醚的分液漏斗中，剧烈震荡2 min,静置 10 min,收集下层液。分别用3 mL甲醇，3 mL水

27、活化混合型阳离子交换固相萃 取柱，准确移取10 mL收集液分次上柱，控制过柱速度在1 mLPmin以内，再用3 mL 水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用3mL氨化甲醇 （V（氨水）BV（甲醇）=5B95）洗脱，收集洗脱液于50e氮吹下吹干。精确量取 90%乙 腈1 mL溶解残留物，涡旋1 min,过0.45Lm滤膜，上机测试。8.4方法的线性范围和检出限分别配制浓度为1,10, 50, 100, 200, 500,1000 n gPmL 的三聚氰胺标准溶 液，在此范围内考察该方法的线性，以浓度与峰面积的对应关系，绘制标准曲线， 线性方程为y= 1519110x-24134

28、92,R 2=019998,线性关系良好。以信躁比 3： 1确 定检出限为0.101 mg/kg。8.5方法的回收率和精密度以空白样品为测试样品，加标水平在10, 30,45ug/kg上。在相同的条件下每 个水平做4个平行,回收率及相对标准偏差见表4.1。表4.1回收率和精密度实验（n=4）化合物加入量/(Lg/kg)测定量/(Lg/kg)回收率/%RSD/%三聚氰胺108.1 7.9 8.5 6.978.58.63025.2 24.3 26.8 27.486.55.54541.3 43.2 42.4 39.892.63.59高效毛细管电泳法9.1原理三聚氰胺呈弱碱性（pKb=8）,在酸性环境

29、下带正电荷，选择在pH2.6的环境下 分离。9.2仪器、试剂与材料毛细管电泳仪高速冷冻离心机pH计。三氯乙酸、柠檬酸（Cit）、Na2HPO4甲醇。三聚氰胺标准品（纯度大于99%） 用甲醇溶液溶解三聚氰胺标准品，配成500mg/L的储备液。用甲醇溶液稀释储备 液,配制成质量浓度分别为1,5,10,20,40,50,80,100mg/L 的工作液。奶粉。 9.3样品前处理奶粉的前处理方法称取2g奶粉样品，加入20mL2三氯乙酸,涡旋1min,超声20min,于9000r/m in速率下离心5min。取10mL上清液过MCX、柱,（预先用3mL甲醇、3mL水活化）。 分别用3mL水和3mL甲醇洗涤

30、，抽干SPE柱,用4mL5氨化甲醇（5mL氨水和95mL 甲醇混匀）洗脱，收集洗脱液，并于50E下用氮气吹干。残留物中加入500uL甲醇 溶液复溶,过滤后上机测定。9.4电泳条件毛细管（有效长度50cm,内径75Lm）;分离电 压25kV;温度25C;进样 3.5kPa（35mbar）*8s;检测波长 232nm 使用前依次用 0.1moL/LNaOH中洗 5m in、 超纯水冲洗5m in、缓冲溶液冲洗20m in;两次进样间用缓冲溶液冲洗3min。9.5数据处理在1100mg/L范围内，三聚氰胺的峰面积（Y）与质量浓度（X,mg/L）之间呈线 性相关，求出线性回归方程，带入求的三聚氰胺含量

31、。9.6方法的准确度和精密度在空白牛奶和奶粉样品中添加三聚氰胺工作液，牛奶的添加水平为0.5,20和 50mg/kg;奶粉的添加水平为1.0,20,50mg/kg,每个添加水平测定5个平行样,计 算回收率和日内测定的相对标准偏差（RSD）;连续测定3d,计算日间测定的RSD, 结果见表5.1。表5.1牛奶和奶粉中添加的三聚氰胺的回收率及日内、日间测定的RSD样品添加量/(mg/kg)回收率/%日内 RSD /% (n=5)日间 RSD/% (n=3)牛奶0.597.02.12.12094.43.03.95091.43.02.4奶粉1.077.12.63.12073.8: 2.83.65073.

32、13.63.610金纳米粒子作探针共振瑞利散射光谱法测定牛奶中三聚氰胺10.1原理在PBS缓冲体系中，金纳米粒子与三聚氰胺形成粒径较大的聚集体，导致 共振瑞利散射（RRS）强度显著增强，在一定条件下，散射强度（ IRRS）与三聚氰 胺浓度成正比，由此建立了以金纳米粒子作光谱探针检测鲜牛奶中三聚氰胺的 新方法.在优化的实验条件下，当三聚氰胺的浓度为3.3 X 1084.7 X10 mol/L 时，其线性关系为： IRRS= 106.98C-28.279, R = 0.9971,检出限为 2.7 X 10-8mol/L.本方法金纳米粒子无需修饰，在体系中仅加入一定量的单链 寡聚核苷酸（T10）,实

33、验表明该方法具有简便、快速、灵敏度高及选择性好等特 点。10.2试剂与仪器试剂柠檬酸三钠、氯金酸、三聚氰胺、NaHP（4?12HO NaHPQ?2HO 乙腈、正己 烷、三氯乙酸，系列单链寡聚核苷酸，碱基均为胸腺嘧啶。仪器荧光分光光度计紫外可见分光光度计电子天平酸度计微量离心机高速离心机旋转蒸发器10.3实验过程配制金纳米溶液、三聚氰胺（Melamine）标准工作液共振散射光谱测定：在1000卩L EP管中加入50卩L, 5.0 X 10一6mol/L寡聚核苷酸 T10（以 0.3 mol/L PBS, pH = 7.4缓冲溶液配制）及50卩L三聚氰胺标准溶液（10 一5 10mol/L）. 静

34、置孵化15 min后加入500卩L, 1.72 X 10_9mol/L金纳米溶液. 利用荧光分光光度计对反应体系的共振散射光谱扫描.设定的激发与发射波长相 同（入二0）,激发狭缝和发射狭缝宽度均为 5 nm,扫描范围为220800 nm, 灵敏度设置为低档，根据所记录570nm处的散射光强度，进行结果分析。10.4牛奶中的测定取按国标法制备的样品储备液，按以上优化的实验条件，采用标准加入法 检验方法检测三聚氰胺的回收率和相对标准偏差（RSD）,结果列于表6.1 o表6.1牛奶中三聚氰胺的测定结果（n = 5）7、的宀 /+一 7心 亠一样品加入量 /(10 -7mol/L)测定值 /(10 一

35、 7mol/L)回收率/%RSD/%10.6250.664106.21.920.8330.80596.65.131.0400.96292.44.242.0801.92092.12.554.1704.180100.23.3实验结果表明，本方法有较好的准确度和精密度，回收率分别为92.1%106.2%, RSD在1.9%5.1%,且样品前处理简单，分析时间短，不需使用大型 仪器，可用于牛奶样品中三聚氰胺的快速检测。11微波消解-流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺11.1原理根据Cr3+对luminol-H 2Q化学发光体系的线性催化作用，首次将KCrQ在强酸性介质中被有机物三聚氰胺还原成Cr3

36、+的反应与luminol-H 2Q-cf+化学发光反应偶合，并结合微波程序消解高效前处理技术和流动注射分析技 术，建立了一种灵敏、准确、成本低廉的测定乳粉中三聚氰胺的新方法。11.2实验仪器离子分析仪电子天平石英亚沸高纯水蒸馏器电热恒温鼓风干燥箱微波消解-萃取仪温控消化炉固相萃取装置低速台式离心机 氮吹仪。11.3实验试剂三聚氰胺标准品鲁米诺三氯化铬双氧水重铬酸钾浓硫酸氢氧化钠乙二胺四乙酸二钠盐盐酸奶粉。11.4实验方法按图3.1所示安装好管道，启动仪器，在设定的工作参数下预热和走基线, 待基线稳定后，注入待测定溶液，进行化学发光强度测定，以相对峰高定量。pw內-鲁來诺溶液；双氧水溶液；Sa-

37、ff.mS液，P-嫦动泵；T三通阀；B-进样阀；流通池；D- 检测器；W”废液池；录器图3.1流动注射化学发光法流程示意图Fig. 3.1 SdieniEiticof flow iiijection dLeniiluiLLinescence analy 对w11.5奶粉样品的前处理及测定提取样品：称取2 g （精确至0.0001 g）乳粉试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1应氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min 后，以4000 r/min 离 心10 min。上清液经1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用 1%三氯乙酸溶液 定容至25.00 mL ,移取5.00 mL滤液

38、，加入5.00 mL水混匀后做待净化液。SPE 净化及样品消解：用3 mL甲醇、3 mL重蒸水水活化阳离子交换固相萃取柱，移取3.00mL待净化液至固相萃取柱中，用 3 mL水和3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽至近干后，用6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不 超过1 mL/min，洗脱液于50 C下用氮气吹干，残留物用 5mL热重蒸水溶解并 转移至容样杯中，加入 2.0 X 10-3mol/L K262Q溶液 3.00mL、（1+1） H2SO4 2.00mL后，在表9.1的消解程序下进行消解。表9.1微波消解程序步骤压强（MPa）时间（min）功率（w）10.3

39、340020.6360031.0380041.210600样品的测定：上述消解液于 300C下在温控消化炉上排酸 10min，冷却后定容于 50mL 容量瓶，取 5mL调至pH2.50,并加入1.0X 10-3mol/L EDTA，定容于100 mL 容量瓶，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。标准曲线的绘制：在设定仪器工作条件下，取不同浓度的Cr3+标准溶液经浓度为0.01 mol/L 1 mol/L的盐酸溶液调至pH2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀， 与 5 X 10-4mol/L 的 luminol 溶液（pH11.70）及 6.0X 10-2mol/L

40、过氧化氢溶液依次 进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线如图 3.2,可知，Cr3+在一定的浓度范围（5.0X 10-7mol/L1.0X 10-5mol/L）内与其相 对化学发光强度有良好的线性关系。11.6化学发光反应条件的选择-4“5X 10 mol/L 的 luminol ；鲁米诺溶液的最佳pH为11.70;Cr3+分析试液的最佳测定pH为2.50;6.0X 10-2mol/L的过氧化氢溶液进行测定；选用K2Cr2O7+ H2SO4体系进行样品的消解；样品的最大消解压力为1.2 MPa；样品的最大消解功率为800W;样品的最长消解时间为10min;K262O7

41、溶液的浓度为 2.0X 10-3mol/L;加入（1+1） H2SO4的体积为2.00mL。11.7回收率加标回收率实验，样品测得的回收率在99.5%100.9%之间。表9.2回收率测定结果样品编号123456本底值（卩 g/g m）-21.8X 10-21.7X 10-21.8X 10-21.8X 10-21.9X 10-21.9X 10测定值（卩 g/g m）1.0131.0151.0211.0180.0281.026加标量（卩 g/g m）1.0001.0001.0001.0001.0001.000回收率%99.599.8100.3100100.9100.712固相萃取一流动注射化学发光

42、法测定奶粉中的三聚氰胺12.1原理三聚氰胺可显著抑制鲁米诺-高锰酸钾体系的化学发光强度，建立了流动注 射-化学发光快速测定三聚氰胺的方法。用于奶粉中微量三聚氰胺的测定，具有 简便、快速、灵敏、准确的显著优点，结果令人满意。12.2实验仪器离子分析仪流动注射化学发光分析仪石英亚沸高纯水蒸馏器，电热恒温鼓风干燥箱低速台式离心机氮吹仪。12.3实验试剂三聚氰胺标准品甲醇乙腈鲁米诺高锰酸钾三氯乙酸氨水碳酸钠氢氧化钠碳酸氢钠盐酸奶粉。12.4标准溶液的配制O.1mol/L高锰酸钾溶液：称取1.5803g高锰酸钾，定容于100 mL容量瓶中，用时稀释即可。8.0X 10-3mol/L三聚氰胺标准储备液、5

43、.0X 10-2mol/L鲁米诺储备液、1% 三氯乙酸溶液、5%氨化甲醇溶液的配制同0.1mol/L高锰酸钾溶液。所有玻璃器皿用5%的硝酸浸泡5h以上，用去离子水和石英亚沸重蒸水洗净 后投入使用。12.5奶粉样品的前处理及测定提取样品：称取2 g （精确至0.0001 g）乳粉试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1%三氯乙酸溶液和 5 mL乙腈，超声提取10 min后，以4000 r/min离心10 min。上清液经1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用1%三氯乙酸溶液定容至25.00 mL，移取5.00 mL滤液，加入5.00 mL水混匀后做待净化液。SPE净化：用3 mL甲醇、3

44、 mL重蒸水水活化阳离子交换固相萃取柱，移取 3.00mL待 净化液至固相萃取柱中，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽至近干后，用6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超 过1 mL/min，洗脱液于50C下用氮气吹干，残留物用热重蒸水溶解，并调pH至2.50，冷至室温后定容于50 mL容量瓶，此为样品待测液，供流动注射化学 发光仪测定。标准曲线的绘制：在设定工作条件下，不同浓度的三聚氰胺标准溶液经浓度为 0.01 mol/L 1 mol/L的盐酸溶液调至 pH2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混 匀，与6X 10-4mol/L鲁

45、米诺溶液（pH12.50）及1X 10-5mol/L高锰酸钾溶液依 次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线。样品的测定：市售奶粉样品经过提取、净化，用盐酸调节pH至2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。实验方法：按图4.2所示安装好管道，启动仪器，在设定的工作参数下预热和走基线，出-兽用诺幡液；R厂岛掘战钾溶液；馳-样砧溶液；P-麵动泉；r-一逋阀；班样阀；流逋池; D-检测器；W废酒池；I-记录器图盅2流动注射化学发光法流程示意圉Fi 寻 4.2 Sclitinaticof flow injectio

46、n diemil mum essence analysis12.6化学发光反应条件的选择鲁米诺的pH值为12.50试液pH 2.50，高锰酸钾浓度2X 10-5mol/L，鲁米诺 浓度 6X 10-4mol/L;高锰酸钾溶液的浓度为1 X 10-5mol/L;三聚氰胺分析液的最佳pH值为2.50。12.7回收率以市售奶粉品牌一为样品，进行加标回收率实验，结果如表10.1所示。由此可知，样品测得的回收率在96.1%102.2%之间。表10.1回收率测定结果样品编号123456本底值（卩g/g m）1.5X 10-2-21.5X 102-21.6X 102-21.5X 102-21.5X 102-

47、21.5X 102测定值（卩g/g m）1.0281.0061.0091.0010.9771.037力卩标量（卩g/g m）1.0001.0001.0001.0001.0001.000回收率%101.399.199.398.696.1102.213三聚氰胺的ELISA检测13.1原理戊二醛法将三聚氰胺(Melami ne)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原 Melamine-BSA及包被抗原Melamine-OVA。对人工合成抗原进行紫外扫描，其紫 外扫描谱图与载体蛋白及三聚氰胺的图谱有明显的差异，初步显示载体蛋白与三聚氰胺偶联成功。进一步分析 Melamine-BSA中Melamine与BSA的

48、摩尔比，复 合物中三聚氰胺与BSA的摩尔比为8156B1。用免疫抗原Melamine-BSA腹腔免 疫BALB/c小白鼠，获得抗三聚氰胺的多克隆抗体，间接非竞争ELISA分析所得抗 血清的效价达10000以上。间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别三 聚氰胺,与氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺无交叉反应。利用自制抗体 建立牛奶中三聚氰胺的间接竞争 ELISA检测方法，对奶样作0.1Lg/mL, 1Lg/mL, 10Lg/mL, 100Lg/mL, 500Lg/mL 和 1000Lg/mL 六个加标浓度的回收率在 70.30% 113.59%。13.2材料仪器材料与试剂：40孔酶标板

49、；三聚氰胺标准品；戊二醛(浓度为75% );牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OV);弗氏完全和非完全佐剂，；卡介苗;羊抗小鼠Ig。主要仪器：UV-265FV分光光度计ZFQ-85A型酶联免疫检测仪。实验动物：BALB/c 小白鼠,健康雄性，4周龄,20g左右。13.3试验方法(1) 抗原的合成：50mg BSA溶于5mLPBS( 0.01mol/L、pH714磷酸缓冲溶液生理盐水)中，5mg 三聚氰胺溶于10mL甲醇中。将5mL GA (浓度稀释到25% )溶液和三聚氰胺溶液 同时缓慢边搅拌边滴加至 BSA溶液中,室温搅拌反应24h, 4000r/min离心5min, 上清以PBS于4C透析3d,即得三聚氰胺-BSA复合物。(2) 抗原的紫外扫描分析：将BSA三聚氰胺以及它们的复合物适当稀释后，BS