分子医学技能：基因组DNA的提取与纯化

1、分子医学技能分子医学技能 利用基因组利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质较长的特性，可以将其与细胞器或质 粒等小分子粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，分离。加入一定量的异丙醇或乙醇， 基因组的大分子基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中， 可用玻璃棒将其取出，而小分子可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。 主要试剂的功能主要试剂的功能 抽提缓冲液：由抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶、蛋白酶K组成组成. SDS: 裂解细

2、胞裂解细胞. EDTA :络合镁钙等二价金属离子络合镁钙等二价金属离子,防止防止 DNA 酶对酶对DNA分子的降解作用。分子的降解作用。 蛋白酶蛋白酶K：水解蛋白质。：水解蛋白质。 酚和氯仿酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀乙醇：沉淀DNA TE：溶解：溶解DNA 实验步骤及注意事项（一人一组）：实验步骤及注意事项（一人一组）： 取材取材: 用生理盐水漱口后，口含生理盐水用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约约23min，取，取10ml 含漱用含漱用10ml离心管（离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀）收集细胞沉淀 （台式离心机的使用，平衡）（

3、台式离心机的使用，平衡） 加入加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至，转移至1.5ml EP管，管， （微量移液器的正确使用）（微量移液器的正确使用） 混匀，混匀，65 温育温育10min 加入等体积的饱和酚加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀，充分颠倒混匀 （不要震荡！）（不要震荡！） 12000rpm 5min，上层水相转移至，上层水相转移至新的新的EP管管 高速离心机的使用与安全意识高速离心机的使用与安全意识 加入等体积氯仿加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀异戊醇，颠倒混匀 12000rpm 5min，上层水相转移到，上层水相转移到新的新的EP管管 加入

4、加入2倍体积倍体积95%的乙醇，颠倒混匀的乙醇，颠倒混匀12000rpm 5min 弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入75%乙醇乙醇12000rpm 2min 轻轻弃去上清，打开轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置盖，室温静置510min 加入加入30 l0.1TE溶液溶液4 保存保存 定性分析：定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 定量分析：紫外分光光度法测定定量分析：紫外分光光度法测定 DNA溶液的浓度溶液的浓度 常见问题：常见问题： 1. 提取的提取的DNA不纯：不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短；变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。离心时间或速度不够。 2. 提取的提取的DNA成涂布状：成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。操作系统有污染。 3. 与细胞器与细胞器DNA分离不全；分离不全； 变性过程不完全；变性过程不完全； 试剂配置问题。试剂配置问题。 操作按钮操作按钮 容量刻度容量刻度 套头套头 20 l 1000 l 100 l 1 0 0 1 0 0 2 0 0 0.